Фагово-плазмидный вектор 131 и способ его конструирования

.ЯО 5/00 4 С ЗОБР ЕТЕНИЯ У СВИДЕ АВТОРС ЬСТВУ ьОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИИ(71) Всесоюзный научно-исследовател ский институт генетики и селекции промьппленных микроорганизмов(56) Еоепеп У, А,М, Вташшат М.Т.А ЬастетдорЬаре 1 ашЬйа честнот тот с 1 опп 8 1 ат 8 е ПНА Гтарептв шаде ютЬ яечета 1 теятт 1 стоп епяушея.Сепе, 1980, 10(3),249.Втеппет Б.Т, Сеяатепд Т, Катп Т. РЬаяшЫя МЬтЫв Ьетдееп СОБЕ 1 р 1 аяш 1 йв апй Е. со 11 Ьастетор 1 а 8 е 1 ап 1 Ь- да, Сепе, 1982,17,27.(54) ФАГОВО-ПЛАЗМИДНЫИ ВЕКТОР 3 р МУР 131 И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инжене рии, и представляет собой фагово-пла змидный вектор (ФПВ)рМУР 131 для прямого отбора рекомбинатных молекул ДНК, их генетического анализа и способ его конструирования. Цель изобретения - создание ФПВ с повьппенной эффективностью клонирования, позволяющего упростить процесс получениябанков генов и облегчить физическийи генетический анализ рекомбинатныхклонов. Для этого из предшественникаФПВ удаляют часть молекулы ДНК, несодержащей генов, существенных дляразвития фага. В результате размервекторной молекулы ДНК становитсяменьше критического размера, необходимого для упаковки в фаговый капсид.Для поддержания векторной молекулыДНК в клетке фрагмент, содержащийвсе гены и участки ДНК, существенныедля развития фага, соединен с фрагментом плазмидной ДНК. Этот фрагментобеспечивает автономную репликациюФПВ в клетке, возможность селекцииклеток. Фрагменты ДНК, содержащиесущественные гены для фагового развития, участок инициации плазмиднойрепликации и ген устойчивости к антибиотику, не содержат сайтов расщепления для ряда рестриктаз. Введениеуникальных сайтов расщепления дляэтих рестриктаз сообщает полученноймолекуле ДНК свойства вектора дляФВП Л рМУР 131. 2 с. и. ф-лы; 2 табл.128000Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой фаговоплазмндный вектор (ФПВ) Я рМУР 131 для прямого отбора рекомбинантных молекул ДНК, их генетического анализа и способ его конструирования. Целью изобретения является создание вектора с повьппенной эффективносО тью клонирования, позволяющего упростить процесс получения банков генов и облегчить физический и генетический анализ рекомбинантных клонов.Поставленная цель достигается тем 15 что из предшественника ФПВ удалили части молекулы ДНК, не содержащей генов, существенных для развития фага, Размер векторной молекулы ДНК в результате удаления этого фрагмента дол жен быть меньше критического размера, необходимого для упаковки з фаговый капсид. Полученный вектор не способен осуществлять литический цикл развития фага. Поэтому для поддержания вектор ной молекулы ДНК в клетке фрагмент, содержащий все гены и участки, ДНК, существенные для развития фага, соединен с фрагмейтом плазмидной ДНК. Этот фрагмент обеспечивает автономную 30 репликацию (ФПВ) в клетке, возможность селекции клеток, содержащих векторную молекулу в плазмидной форме по маркеру устойчивости к ампициллину плазмиды рБС 19. Фрагменты ДНК, ссдержащие существенные гены для фагового развития, участок инициации плаэмидной репликации и ген устойчивости к антибиотику, выбраны таким образом, что не содержат сайтов расщепления для ряда 4 О рестриктаз. Введение уникальных сайтов расщепления для этих рестриктаз сообщает полученной молекуле ДНК свойства вектора для ФПВ Л рЯУР 131 .ФПВ состоит из следующих элементов.4Гены и регуляторные области, необходимые и достаточные для лятического цикла развития фага, в том числе левое плечо ДНК фага й 47 АВ от участка ш (координата О т.п.н) до сайта 5 О расщепления рестриктазой Бща 1 (координата 19,3 т.п.н), правое плечо ДНК вегетативного фага 1 дЮЕБ от сайта расщепления Ваш Н 1 (координата 34,5 т,п.н.) до участка ш (координата 48,5 т.п,н.), координаты приведены по ЧК фагадикого типа.Ген С 1, кодирующий термочувствительный белок-репрессор фага Я, с му 9 2тацией 857, Присутствие 1 з-мутации вгене репрессора С 1 позволяет индуцировать фаговую репликацию при повьппении температуры. Э. о обеспечиваетпростой и эффективный способ амплификации как векторнок ДНК, так и ДНКрекомбивантных на с снове ФПВ, Упомянутая амплификация увеличивает копийность ДНК в 20-50 раз. Такая амплификация может быть применена для облегчения выделения ДНК-вектора и гибридов на его основе. Присутствие гв-мутации в гене С 1 обеспечивает большую безопасность при работе с рекомбинангными ДНК на основе ФПВ, поскольку при температуре выше 37 С невозможно поддержание ФПВ в плазмидной форме, и клетки, содержащие плазмидугиб пут.СЬ 1 - сайт в гене л фага 3, необходщьй для получения высокого титра фага в отсутствие продуктов генов ген и яап 1.Гены А,В и Б в амбер-форме, что позволяет литическое развитие ФПВ на основе рМУЕ 131 только на штаммах Е.со 1 г, содержащих имбер-супрессор ВОР . Наличие амбер-мутаций ограничивает литическое раэп итие рекомбинантных ФПВ в подавляющем большинстве природных штаммов, чувствительных к фагу 1 . Мутация в гене Б удлиняет период репликации ДНК ФПВ после индукции фагоспецифиче ской репликации, что позволяет увеличить количество выделяемой ДНК ФПВ, и рекомбинантных молекул ДНК на его основе. Мутация в гене А препятствует надреэанию сверх- скрученных молекул ДНК, накапливающихся после индукции фагоспецифической реплккации, что позволяет использовать для выделения ДНК методы выделен ия плаэ мидной ДНК.Участок индикации репликации (ог) плазмиды рБС 19 исходно содержащийся в плаэмиде рИВ 1, размером О, 6 т. и н Присутствие ог обе спечи-вает поддержание век."орной молекулы в плазмидной форме, эффективное установление лизогенного (плазмидного) состояния при инфицировании клеток фаговыми частицами, содержащими гибридный ФПВ. Присутствие такого репликона, кроме того, обеспечивает большую безопасность при работе с. рекомбинантными ДНК на основе ФПВ при повышенной температуре, поскольку при" сутстние реэистентного гомоиммунногоки расщепления для рестриктаз Есо 47 Ш,Хшай.Рекомбинантные ФПВ со вставкамиДНК размером не менее 4 т.п.н. посайтам Есо К 1, Бас 1, Ба 1 С 1, ХЪа 1,Есо 47 111 и Хаза 111 способны развиваться подобно недефектному фагу 3или могут поддерживаться в клетке,содержащей рекомбинантный ФПВ, в плаэ 1, В несущественмидной форме, ной зоне Ферменты, образующие фрагментыДНК с гомологичными липкими конФерменты, имеющиеуникальный участокрасщепления на ДНКЯ рМР 131 цами Есо К 1Са 1 СТ, ХЬо Т ХЬа 1, Ачг 11Бас 1 Хша 111, Сйг Т, Ног 1Все, ферменты, образующие фрагменты ДНК ступыми" концами Есо КТБа 1 С 1ХЪа 1Бас 1Хша 111 Есо 47 11 Т 11. В существенной зоне То же11 Мгц 1Бпа В 1Бас 11 Бас 11, Вйс 11,Нас 11 Аяц 11, Наг 1, М 1 ц 1, Вяе Р 1, Аяу 1, Тая 1, Мяр 1, Нкпс Р 1, Мас 11 Аяц 11 3 12800профага в индуцированной клетке неспособно репрессировать литическоеразвитие ДНК ФПВ. Это приводит к гибели индуцированных лйзогенных клеток.Ген (3 - лактамаэы (размер 1,1 т.п. н), обеспечивающий устойчивостьклеток к ампициллину (маркер Ар )плазмиды рОС 19, исходно содержавшийся в транспозе ТпЗ. Присутствие вфазмиде маркера Ар позволяет использовать данный маркер в качес.тве селективного или контрольного при комплементационном анализе рекомбинантного ФПВ.Полилинкер - последовательностьмолекулы ДНК, имеющую набор близкорасположенных участков расщепленияряда рестриктаз: Нпд 111, БрЬ 1,Ряг 1, Ба 1 С 1, ХЪа 1, Ваш Н 1, Бша 1,Крп 1, Бас 1, Есо КТ, в том числеуникальные участки рестрикции Есо К 1,Бас 1, Ба 1 СТ, ХЪа 1,Уникальные участки рестрикции, помимо полилинкера, имеются также в не 25существенных для литического развитияобластях молекулы ДНК ФПВ. Это участПри расщеплении рестриктазойБа 161 возможна встройка в ФПВ фрагментов ДНК, расщепленной рестриктазами 40БаТС 1, ХЬо 1.При расщеплении вектора рестриктазой ХЬа 1 возможна встройка в ФПВфрагментов ДНК, расщепленной рестриктазами ХЬа 1 и Ачг 11. При расщеплении вектора рестриктазой Есо 47 111возможна встройка в ФПВ фрагментовДНК, расщепленной рестриктазами с полностью спаренными ("тупыми") концами,которые образуются под действием различных рестриктаз,Уникальные участки расщеплениядля рестриктаз Игц Т, Бпа В 1, Бас 11и Аяц 11 в областях ДНК ФПВ, существенных для ее развития по литическому 55пути.Вставка фрагментов ДНК по укаэанным участкам расщепления обеспечивает большую безопасность при работе с 09 4рекомбинантными ФПВ благодаря блоку литического развития гибридных ФПВ, Гибридный ФПВ, полученный подобным образом, способен поддерживаться в клетке лишь в форме плазмиды. При использовании рестриктаэы Игц 1 и Бпа В 1 возможна встройка в ФПВ фрагментов ДНК с "тупыми" концами. При использовании рестриктазы Аяц 11 возможно клонирование фрагментов ДНК, полученных под действием рестриктаз Аяц 11, Наг 1, МТц 1, Вяе Р 1, Асу Т, Тая 1, Мяр 1, Нп РТ, Мае 1 Т.Суммарный размер ФПВ 3 рМУР 131 32 т.п.н, (653 от размера ДНК фагаЯ дикого типа).Клонирующая емкость сконструированного вектора одинакова для каждой из указанных рестриктаз и составляет 4-21 т,п.н.Анализ векторных свойств 1 рМУР 131 приведен в табл. 1. Таблица 1 Рестриктазы, которые могут быть использованы при клонировании в 3 р МУР 13140 45 50 55 5 128П р и м е р 1, КонструированиеФПВ обладающего требуемой структурой, проводится в два этапа,На первом этапе совместили в составе одной молекулы фаговой ДНК всеперечисленные элементы таким образом,чтобы все необходимые участки ФаговойДНКможно было легко присоединить кплазмидной части. В качестве исходного материала для конструированияиспользовали ДНК фагового вектораЯ КС ИЕЯ ( Иаш Еаш Яаш пп 5) и сконструированного нами ранее ФПВрМУР 15 (, 47 АВееДАЯ 7)Предполагалось соединить в составе одной молекулы левый ЕсоК 1 - фрагмент 1 рМУР 15 и правый ЕсоК 1 - фрагмент фага А 8 й ЫЕЯ, рМУР 131 пред -ставляет собой гибридную молекулуДНК ФПВ, содержащего плазмиду Й АЮ,которая утрачивается при дальнейшемконструировании. Из,1 р МУР 15 в конструируемую молекулу переходит сЫсайт из фага81 УЕЯ - область иммунитета фага с геном С 1, содержащиммутацию с 1857. В процессе конструирования 1 мкг ДНКй РЕЯ и 0,1 мкг ДНК, р МУР 15, расщепленных рестриктазой Есо К 1, лигировали в объеме 3 мкл, паковали и чг.го в капсид фага 1 и высевали на газон бактерий Е.со 1 И 3350, ке содержащих амбер-супрессора. На этом газоне могли образовать негативные колониир МУР 15 и гибрид, получивший левое плечо ФПВ и правое плечо фага, так как в левом плече ФПВ в составе плазмиды 11 АМ 7 содержится ген Яцр Р, супрессирующий амбер-мутации, присутствующая в гекомах фага и 3 р МУР 15. Фаг8 г РЕЯ и гибрид содержащий правое плечо ФПВ и левое плечо ф га, не может расти на газоне бактерий И 3350, так как содержит в своем составе амбер-мутации и не содержит амбер-супрессора. Маркером для обнаружения правого плеча фага дГ. ИЕЯ в составе гибридной молекулы является признак иммунностк к ФагуПравое плечо А р МУР 15 определяет иммунитет к фагу 434. Чтобы различить два типа фаговых частиц, выросших на газоне бактерий Ы 3350, их иммунитет проверяли с помощью спот-теста. Иэ фаговых частиц, способных к росту на бактериях О 358/ 3434 и ке способных к росту на бактериях Я 358 (1) при 30 С, т,е содержащих область 0009 6имукитета Фага 3 рС. РЕЯ, выделили ДНК, По данным расщепления рестриктазой Есо К 1 эта ДНК соответствовала искомому гибриду между фагамиЮЯ и р МУР 15, Один иэ полученных клонов обозначенных 4 р МУР 17, использовали для дальнейшего конструирования. На втором этапе конструирования Ваш Н 1 плечо Фазмицы 1 р МУР 17, содержащее все гены, необходимые для литического развития Фага 3:СЫ-сайт и генС 1, кодирующий термолабильный рас.прес-сор (С 1 ), соедин или с плазмидойрПС 19 расщепленкой этой же рестриктазой Плазмида рЕС 19 представляетсобой делеционкый вариант плаэмидырВК 322, содержащий фрагмент 1 ас- оперона Е,со 1. Этот фрагмент обеспечивает с- - комплемекткцию Ферментативнойактивности р - галактозидазы в штаммах, содержащих делецию а М 15, такихкак например Е, со 1 ТС. 1 мкг ДНКр МУР 17, выделенной в фаговой форме,расщепленной рестрьжтаэой Ваш Н 1, лигировалк с 001 мкг плаэмиды рПС 19,расще пленной этой л е ре стрик таз ой.Смесь лигированкых Фрагментов ДНКиспользовали для трансформации компетентных клеток Е.со 1 ТС 1 , которые высевали ка среду с пенициллином, содержацую хромогенный субстратХ-Еа 1 и ИПТГ. Из неокрашенных колонийвыделилк гибридные плазмиды. Гибридную плазмидную ДНК эдкого из клоновобозначилир МУР 131, Для получениябольших количеств векторной ДНК, р МУР 131 (до 307. зт всей клеточной ДНК) осуществляют амплификацию ДНКФаэмиды путем термоккдукции фаговойре пликации.ФПВ 3 р МУР 131, конструированиекоторого описано в пркчере 1, используют для получения векторной ДНКи для создания банка генов,П р и м е р 2. ФПВ ДНК трансформировали компетентные клетки штаммаЕ.со 1 НВ 101, являюп,егося гесА, ЯцрФПВ содержит амбер-мутации в генахА и Я, Мутация в геке Я позволяетувеличить время фагсспецифическойрепликации ФПВ. Мутация в гене А иотсутствие в ФПВ генов ген и яаш позволяет выделять ФГБ, пользуясь методами выделения сверхскрученных ДНК,поскольку в клетке отсутствуют Ферменты гес, гей систе и и белок А, которые могут релаксирэвать реплицирую-,Т а б л и ц а 2 Получение банка генов Е.со 1 д С 600 Обработка фер- Хромосомная ментами ДНК, расщепленная Есо К 1 Титр фаговых частицна газоне бактерий Номер ДНК вектора, мкги/пр ИУГ 131 47.1 АВ селективнеселе тивных Я 05003 лига Ч 1500,0 2,7 10 ых бактерий способны ии как гибридные, так е селективных бактер ивные колонии только П р и м е ч а н и е. 1. На газоне неселективвывать негативные колон гибридные фаги. На газо собны образовывать нега ные фаги.2 . Неселективный штамм ридная фазмида способна существует.Вектор47.1 АВ позволяет отбиратьфаги, содержащие только гибридные молекулы ДНК, из смеси гибридных и негибридных фагов, образующихся послеупаковки молекул ДНК, полученных врезультате лигирования векторной иклонированной ДНК, На газоне бактерий, содержащих профаг Р 2, образуютнегативные колонии только гибридныефаги. В данном случае используется аз не- спо- ибрид бактерий,к литическ отором негибразвитию, не штамм Е.со 1 ЯО 5003 (Р 2). Для контроля общего количества фаговых частиц в популяции смесь фагов высевают на газон бактерий 5003, на котором образуют негативные колонии как гибридные, так и негибридные фаги,Результаты, приведенные в строке 1 колонки 6 (табл.2), характеризуют качество ДНК вектора 447.1 и качество смеси для упаковки ДНК. Строка 2 7 1280009 8щийся ФПВ ДНК.,В логарифмической куль-. Е.со 1 д С 600. Средний размер фрагмен- туре клеток Е,со 1 НВ 101, содержа- тов хромосомы при выделении превышал щих -ФПВ, индуцировали фаговую репли т,п.н. Эту ДНК обрабатывали ресткацию, повышая температуру инкубации риктазой Есо М, варьируя количество с 30 до 45 С, и инкубировали при 5 фермента от 2 до 0,02 ед на 1 мкг 45 С в течение 15 мин. Затем культуры ДНК. Два препарата фрагментов ДНК со растили 2 ч при 37 С. Из выросших средним размером 15 т.п.н. лигировали клеток выделяли плаэмидную ДНК в ко- с расщепленным вектором в весовом личестве 1 мкг из 1-2 10 бактериаль- отношении 1: 1.8ных клеток, что соответствует 25-50- 10 Данные по эффективности образовакратной амплификации плазмилы. ния гибридных молекул на основе векП р и м е р 3. Хромосомную ДНК торов47.1 АВ и 3 р МУР 131 приведены выделяли иэ ночной культуры клеток в табл.2.1280009 45 11титр . с 10 на 1 мкг ДНК), от всехФПВ, полученньж при упаковке лигированной смеси ДНК и образующих негативные колонии (строка 7 колонки б,титр 3,0 10 на 0,1 мкг ДНК), составляет менее 10 (0,003%).Сравнение качества банка, полученного на основе вектора-прототипа и47.1 АВ (доля негибридных фагов 12 .),с качеством банка, полученного на основе предлагаемого 1 р МУР 131 (долянегибридных фазмид менее О,ООЗ ),показывает, что качество банка на основе предлагаемого вектора значительно выше - доля негибридных частиц в 15банке, полученном на основе ФПВ4 р МУГ 131, по крайней мере в 4000раз меньше, чем в банке, полученномна основе вектора-прототипа,Таким образом, по двум взаимосвязанным параметрам (уровню фона икачеству банка) предлагаемый ФПВр МУГ 131 значительно превосходитвектор-прототип47.1.АВ. В планепрактической работы по конструированию банков генов это превосходствовыражается в гораздо меньшей вероятности получения ложного банка - популяции негибридных бляшкообразующихчастиц, полученных после упаковки 30смеси расщепленной и лигированнойДНК вектора и клонируемой ДНК.Сравнение эффективности образования гибридных молекул ДНК на основепредлагаемого ФПВр МУГ 131 (строка 357 колонки б, титр 3,0" 10 на 0,1 мкгДНК вектора) и на основе векторапрототипа и базового образца 47.1 АВ(строка 4 колонки 7, титр 0,5;10 на-,0,1 мкг ДНК вектора) показывает, что 40эффективность образования гибридныхмолекул на основе предлагаемого векторар МТГ 131 в данном примере вб раз выше. В плане практической работы по конструированию банков генов это превосходство предлагаемого вектора выражается в большем количестве гибридных молекул, получаемых в расчете на оди каковое количество клонируемой ДНК.П р и м е р 4. Использование гибридного ФПВр МУГ 131 для генетического анализа, Проведен поиск генов комплементирующих мутаций аго С и рго А Е,со 1. Обнаружение указанных генов необходимо для конструирования микроорганизмов - продуцентов аминокислот. 12Банк генов Е.со 1 получен для обнаружения в нем ФПВ, несущих ген аго С. Одновременно определяет частоту встречаемости ФПВ, несущих гены пролинового оперона. Поиск ФПВ, содержащих искомые гены, проводили с помощью комплементации соответствующих ауксотроф" ных мутаций бактерий штамма Е.со 1 АВ 3252 рго А, аго С. Инфицированные ФПВ клетки высевали на селективные среды, содержащие пенициллин, а также стрептомицин, являющийся селективным маркером реципиентного штамма, и не содержащие либо пролин, либо ароматические аминокислоты - триптофан, тирозин и фенилаланин.Титр популяции ФПВ составлял 3,1 х х 10 фаговых частиц. Титр трансдуктантов, выросших на полной среде с пенициллином, равнялся 4,5 10 при множественности инфекции нри трансдук. ции 1 фаговая частица на 10 бактерий. Эффективность трансдукции пенициллинового маркера популяцией гибридных фаговых частиц составила 15 Х, Доля Ар колоний, прототрофных по пролину, среди всех Ар" колоний составила 1,7 х х 10. Для колоний, прототрофных по триптофану, тирозину и фенилаланину, эта величина составляла 0 3 10-ф.эИз колоний Ар , аго С выделили плазмидную ДНК, как описано в примере 3. ДНК упаковали 1.п чегго в капсид фага , как описано в примере 3, и высеяли на газон чувствительных бактерий. Из отдельных фаговых колоний получили препараты фагов высокого титра, которые трансдуцировали маркер аго С сцепленно (1003) с маркером Ар Таким образом, получены гибридные фазмиды, производные,1 р МУГ 131, содержащие искомый ген аго С.Предлагаемый вектор 1 р МУГ 131 является первым ФПВ, который можно использовать для получения популяции только гибридных молекул благодаря новому принципу для фаговьж векторов - дополнению генома фазмиды до пакуемого размера. Формула из обре те ния 1. Фагово-плазмидный вектор, предназначенный для получения и анализа банка генов, имеет размер молекулы 33 т.п.н. и состоит из следующих элементов:Составитель Н,КуэеяковаРедактор Л.Веселовская Техред Л,СердюковаКорректор А,Тлско Заказ 268 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, уп, Проектная, 4 13 1 800Гены и регуляторные области, необходимые и достаточные для литического цикла развития фага 1, в томчисле левое плечо ДНК вегетативногоФага47,1 АВ от участка ш (координата 0 т,п.н.) до сайта расщеплениярестриктазой Бтпа 1 (координата 19.3т.п.н,), правое плечо ДНК вегетативного я г ИЕБ от сайта расщегленияВаш Н 1 (координата 34,5 т.п.н.) до 10участка (координата 48,5 т.п.н.)координаты приведены по ДНК Фага/дикого типа.Участок инициации репликации (ог)из плазмиды рПС 19 размером 0,6 т,п,н, 15Ген ф -лактамазы, обеспечивающийустойчивость клеток к ампициллину(маркер Ар, размер 1,1 т.п.н,) изплазмиды рПС 19.Полилинкер - последовательность 20молекулы ДНК, имеющая набор близкорасположенных участков расщепленияряда рестриктаз; Нпд 111, БРЬ 1,Рз 1, Ба 1 С 1, ХЬа 1, Ваш Н 1, Бша 1,Крп 1, Бас 1, Есо Е 1, в том числеуникального участка рестрикции; ЕсоК 1, Бас 1, Ба 1 С 1, ХЬа 1,Уникальные участки рестрикции внесущественных для литического развития областях Фагово-плазмидного 3 Овектора: Есо 47 111, Хша 111,Уникальные участки расщеплениядля рестриктаз Игц 1, Бпа В 1, Бас 11,Азп 11 в областях Фагсво-плазмидноговектора, существенных для ее развития 35по литическому пути.Ген с 1, кодирующий термочувствительный белок-репрессор Фаг, с мутацией 857.СЬ 1 - сайт в гене Г Фага 1, необходимый для получения высокого титра 09 14фага в отсутствие продук тов гена ген8 аш.Гены А, В и Б в амбер-форме, что позволяет литическое развитие фаговоплазмидного вектора и его гибридов только на штаммах Е.со 1, содержащих амбер-супрессор БпрЕмкость вектора одинакова для каждой из указанных рестриктаз и составляет 7 - 21 т.п,к.Возможными хозяевами для плазмидного размножения фагово-плазмидного вектора 3 р МУР 131 являются штаммы Е,со 11, адсорбирующие фаг, в которых может происходить репликация со 1 д-подобных плазмид; 1 актерии ТС 1 ( ) . 2. Способ конс груирования фаговоплазмидного векто а 1 р МУР 131, предназначенного для получения и анализа банков генов, заключающийся в том, что ДНК Фага 1 47, 1 А 13 и плазмиды ЯаИ 7 расщепляют рестриктазой СГг 91, лигируют, упаковывают п чГго и высевают на пермиссивный газон Е.со 1 И 3350, полученный гибрид 1 р МУР 15, содержащий встройку плазмиды в левый сайт расщегления СЕг 91, гидролизуют эндонуклеазой Есо К 1 и лигируют с расщепленным этой же эндонуклеазой фагом /, дГ ЖЕБ, упковывают ж угГго, отбирают по маркерам правого плеча фага Я 8 г ЫЕБ (1 дпп 1 ) и плазмиды УаМ 7 (зпр Р), этот гибгид названный 3 р МУЕ 17, расщепляют рестриктазой Ваш Н 1 и лигируют с плазмирой рПС 19, расщепленной этой же рестриктазой, трансформируют бактерии Е. со 1 ТС 1 (2) и отбирают по маркеру Ар и термочувствигтельности (йз), из которых выделяют Фа гово-плазмидный гибрид Ьр МУР 131.