Способ получения мембраносвязанных соединений

1823876 10 1510,4Элементарный анализ: 50 55 в этаноле, трифторэтаноле, метаноле, 1.1.1,3.3.3-гексафторпропаноле, воде, а также в смеси этанола с водой измерили с помощью дихрографа 11 (фирма "Юхан-Руссел"). Хроматографическая очистка Защищенные промежуточные ступени пептида до окончания реакции сочетания и удалении растворителя в масляном вакууме растворили путем добавки одинакового объема СНС 1 з/МеОН 1:1, отцентрифугировали от дициклогексилмочевины и хроматографировали на сефадексеН 20: колонна 3 х 115 см; растворитель СНС 1 з/МеОН 1:1; количество 35 мл; скорость течение 8.40 мл/10мин, Фракции по 3 мл исследовали в систе ме 11 методом тонкослойной хроматографии (препарат ТОМ), Пептиды появились в объеме растворителя 165-190 мл, Фракции объединили, удалили растворитель в вакууме, остаток высушили над Р 205, Аминокис лотный анализ дал ожидаемые значения и содержание пептида 92 - 96 (,.П р и м е р 1, Получение РэвзСуз-ЕдГ- й(516-529)После обычного ступенчатого синтеза 25 (синтез Меррифилда) под защитой Й - Е.аос/(Вц ).Оос/НОВт и симметричных ангидридов) сегмента ЕдЕ - й (526 - 529) получили последней аминокислоту овос-Яе(Вц)-ОН. После отщепления защитной группы смесью 30 пиперидин: ОМЕ (1:1, 15 мин) связанный со смолой пентадекапептид ЕдР-ВН.Бег(ВцИАзп-ец-.ецо(0 Вц)-Сузц-Рго - Аг(Н) -6 о(ОВц)-РЬе - Ча - 6 о(ОВо) - Азп - Яе(Во ) -0-р-алкокси-бенэил-сополи(дивинил бензол-стирол) (1 г, загрузка 0,5 ммоль/г) был соед и не н с Р а азСузОН(РааО)(СН 2 СН (РавО)ЯСН 2 СНч Н(ОРав) (2 ммоль,1СО - ОН 40в ОМЕ/СН 2 С 12 (1:1 и ОС 1/НОВт (2 ммоля,при 0 С, с предварительной активацией втечение 20 мин (16 ч), затем дополнительноесоединение (4 ч). Липогексадекапептид былотщеплен трифторуксусной кислотой (5 мл) с 45добавлением тиоанизола (0,25 мл) в течение 2ч,Выход;960 мг - (76 ) РавзСуз - Яег-Азп- ец- .ецц - 6 уо-Рго-Агд - 61 о-РЬе- Ча ц-Азп - Бег - ОН х СЕзСООНаминэкислотный анализ2,00 (2), 1,97 (2), 4,29 (4), 0,88 (1), 1,05 (1), 1,13 (1), 1,12 (1), 0,98 (1), 1,02 (1)Температура разложения 173 С.Индекс Й 1: система Н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (2:1:1) 0,62.Молярный вес 2 616,21 (в виде трифторацетата) БруттО-фОрмула С 24 Н 2 Й 200 з 45 Гз П р и м е р 2. 1. Получение РавзСузЗе уз)40 НРавзСузЯеп, уз)4 - ОН был синтезирован по методу твердой фазы (МЕ РРИ ФИЛД) на сополимере р-алкоксибензилспирт-,РЯОИВ (1) с й - Рвос-аминокислотами и кислотонеустойчивой защите боковой цепи (1-В ц для серина и Вос для лизина). Применены симметричные ангидриды Евос-аминокислот. Сцепление на РаазСузОН было осуществлено по методу ОСС/НОВт и повторено для достижения лучшего количественного преврвщения, Для отщепления липопептида от смолы-носителя и для удаления защиты боковой цепи смолу два раза в течение 1,5 ч обрабатывали трифторуксусной кислотой, которая в заключение была удалена в ротационном выпарном аппарате в высоком вакууме. Продукт был перекристаллизован из ацетона,Элементарный анализ, как и С-спектруказывает на то, что липопептид представлен в виде трифторацетата. Принимая, что РавзСузЯеК уз)4 - ОН представлен в виде амфотерного иона, остаются еще три е -аминогруппы, которые могут быть протонизированы от трех молекул трифторуксусной кислоты,С-ММВ-спектр РавзСуз- Яег-( уз)40 Н ЗТГЕ показы лает, что соединение представлено в виде трифторацетата (квартет СРз-групп при 110-120 частях на миллион, а также карбонильные сигналы при 161 - 162 частях на миллион). Вследствие агрегации полярной части молекулы линииуз и Бег - С-атомов значительно расширяются, Карбонильный сигнал при 206,9 частях на миллион происходит от остающегося ацетона, примененного для перекристаллизации.Молекулярный вес: Расч, С 56,40 Н 8,70 И 7,56 Я 1,73 Осажд, С 55,58 Н 9,33 М 6,54 52,61 Аминокислотный анализ:Аминокислотный анализ выявил соотношение серина к лизину 1:4.2. Образующиеся при гидролиэе характерные продукты разложения (6 ч НС 1, 110 С, 18 ч) 3-глицерил-цистеина были в наличии (сравнение с известными стандартами). Доля пептидов рассчитана на 83, 3 молекулы ТРЕ на липопептид соответствуют доле пептида 80,2, хорошо соответствуя анализу.11. Получение РаазСуз - Бег-(1 уф-ОН х ЗТЕЕ 11, 1. Сцепление Еаос - уз(Вос)ОН на смоле-носителе Еаос -уз(Вос)-ОН (4,5 г, 9,6 ммолей) примешивают в 15-20 мл ОМГ (СН 2 С 1:1) ч/ч (при 0 С с ОСС (0,99 г, 4,8 ммолей), Через 30 мин отфильтровывают от осажденной мочевины в утку для встряхивания, в которой помещены р-бенэилоксибе нзил-сп ирт-смол а (2,5 г, 1,6 ммолей ОН-групп). После добавки пиридина (0,39 мл, 4,8 ммолей) встряхивают в течение 18 ч при комнатной температуре, Растворитель отсасывают и смолу 3 раза промывают каждый раз 20 мл ОМЕ/СН 2 С 12 и ОМЕ. Смолу сначала смешивают в 20 мл СН 2 С 2 с пири- дином (28,8 ммолей, 6 А 9) и затем с бенэоилхлоридом (28,8 ммолей, 6 А 9). Встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Растворитель отсасывают и смолу промывают 3 раза 20 мл СН 2 С 12, ОМЕ, иэопропанолом и РЕ/50,П. 2. Симметричный ангидрид Ггпос-аминокислоты Еаосуз(Вос) - ОН (4,5 г, 9,6 ммоля, 3 А 9) растворяют в 15 мл СН 2 С 12/ОМЕ и смешивают при 0 С с ОСС (4,8 ммолей, 1,5 А 9). Через 30 мин при 0 С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и обрабатывают дальше, как указано в нижеследующей таблице.Следующее положение пригодно для 1/5 применечного в начале количества смолы (0,5 г, 0,32 ммоля ОН-групп).Епос-бутил-серин (г),74 г, 1,92 ммолей) растворяют в 4 мл СН 2 С 2/ОМЕ и смешивают с ОСС (0,96 ммоля) при 0 С,Через 30 мин при 0 С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и, как обычно перерабатывают.11. 3. Присоединение к РаазСуз-ОН РаазСуз-ОН (0,58 г, 0,64 ммоля) растворяют в 5 мл СН 2 С 12 (ОМГ 1:1) и при 0 С смешивают с НОВт (93 лг, 0,64 ммоля) и ОСС(0,64 ммоля), Через 30 мин при 0 С смесь загружают непосредственно в реактор, Через 16 с встряхивания осуществляют дополнительное сцепление с вышеуказанным молярным отношением в течение 4 ч. Растворитель отсасывают и смолу промывают три раза 20 мл ОМЕ/СНГС 12 и ОМЕ. 11. 4. Отщепление гексапептида от полимераВос - защищенное соединение пептида и полимерной смолы (около 1 г) из 11. 3 хорошо промывают СН 2 С 12 и 2 раза в течение 1,5 ч встряхивают со смесью иэ 5 мл ТЕЕ и 0.5 мл анизола. Фильтрат концентрируют в вакууме, а остаток помещают в 5 мл СНС 1 з, РаазСуз-Бег( уз)ОН х ЗТГЕ кристаллиэовывается после добавки 50 мл ацетона при- 20 С, центрифугируется и сушится в высоком вакууме.Выход:5 0,41 г (85)Температура плавления:205 С (разл.)Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля:10 В - 042(растворитель: и ВцОН /МеОН/Н 20/ле дяная уксусная кислота - 10;4:10:6)Аминокислотный анализ:Яег 0,95(1); уз 4(4)Молекулярный вес:С 87 Н 159 М 100193 Е 9 (1852,6) 20 Элементарный анализ:Расч, С 56,40 Н 8,70 М 7,56 Я 1.73Осажд. С 55,58 Н 9,33 й 6,94 Я 2,61 111, Получение РаазСуз-Бег-(1 уз)а-ОН Е 1 С х 2 ТЕЕФлюоресциинизотиоцианат (3,9 мг, 10микромолей) растворяют в 2 мл хлороформа и добавляют в раствор РаазСуз-Зег-( уз)4- ОН х ЗТЕЕ (18,5 кг; 10 микролюлей) в 2 мл 30 хлороформа, После добавки 4-метилморфолина (10 микролитров, 10 микромолей) перемешивают в течение 1 ч и затем растворитель удаляют в ротационном выпарном аппарате. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа 35 и ацетона 1:1. Желтый продукт выпадает восадок при - 20 С, его центрифугируют и сушат в высоком вакууме.Выход;16 мг после очищения сефадекс 1 Н 20 40 Продукт представлен в виде трифторацетата и очень сильно флуоресцирует при возбуждении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 366 нм-. По сравнению с исходным продуктом г -аминогруппа ковалент но связана с Е 1 ТС. Из этого следуетсуммарная формула РааэСуз - Бег-(.уз)а- ОН-Е 1 ТС х 2 ТЕЕ с условием, что амфионная структура сохраняется,Молекулярный вес;50 С 106 Н 169 Й 1102252 Еб (2127.68)Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля;й = 0.72Имеются продукты гидролиза глицерилцистеинаЧ. Получение РаазСуз-Яег-(уз)4-ОН х ЗНСРаазСуэ-Яеп, уз)4 ОН х ЗТРЕ 185,2 мг (0,1 ммолей) растворяют непосредственно в небольшом количестве хлороформа и добавляют приблизительно такое же количество эфирного раствора НС 1, Хорошо встряхивают, причем часть выпадает в осадок, но большая часть остается в растворе. Вращают в ротационном выпарном аппарате до получения сухого продукта и снова добавляют эфирный раствор НОПосле многократного повторения этой операции растворяют остаток в небольшом количестве хлороформа и добавляют ацетон до помутнения раствора. Продукт кристаллиэуют в бесцветный порошок при - 20 С, отсасывают и сушат в высоком вакууме,Выход:153 мгМолекулярный вес:СвН 159 М 1001 зЯС 1 з (1619,63)Элементарный анализРасч, С 60,07 Н 9,89 М 8,65 Осажд, С 57,64 Н 11,20 й 8,39 В продукте остается излишняя Н С 1, Масс-спектромегрия с десорбцией поля:М .пик появляется при гп/е 1510, а также М1 и М + 2, Характерны протонированные фрагменты РавзСув - ОН (908,5) при гп/е 910, 909, 911 и 912.Опыты по иммунизацииОсуществлена ковалентная связь В-клеточного митогена, который является одновременно отличным носителем и сильно действующим катализатором, с синтетическими антигенными детерминантами. С этой целью был применен синтетический липопептид 5-(2,3-бис(пальмитоилокси)пропил)- й-пал ьмитоил-цистеинилсерин(Рэ азСуз - Яег), представляющий собой й-терминал липопротеина из внешней мембраны эшеришиа коли. Особенно выраженные в ковалентной связи с антигеном амфифильные свойства обеспечивают, с одной стороны, стабильное сцепление несущего три остатка жирной кислоты соединения 5-глицерила в липидном слое клеточной мембраны, С другой стороны, в результате этого во внешнем гидрофильном слое мембраны представлен более полярный антиген (или гаптен), Так как активирующее действие липопротеина определяется только его М-терминальной частью, то во всех коньюгатах, несущих РагпзСуз-Бег или аналогии, сохраняется их иммумостимул ирующее действие.5 10 15 20 25 30 35 40 455055 В качестве примера на фиг.1 приведено применение концепции получения специфических антител против рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЯ-В). Для этого путем эпитопного поиска с использованием ЭВМ была выбрана экстрацитоплазматическвя область 516-529, построена синтезом Меррифилдв и затем нвдстроен Рвос-Зеп 1 Ви) - ОН и затем Ра азСуз-ОН. После отщепления смолы аналитическим путем признанный единым конъюгат без других добавок был применен 1.р для мышеи в одной единственной дозе. С помощью теста ЕОэа уже через 2 недели были установлены высокие титры специфических антител против тетрадекапептида. Важно, что при контрольных опытах одним очевидно иммуногенно слабым тетрадекапептидом не получены титры антител,Так как РапззСуэ-конъюгаты сильно иммуногенны и в клеточных культурах, путем иммунизации 1 п ч 11 го можно быстрым и элегантным образом получить условные и моноклональные антитела против слабо иммуногенных соединений.Преимущества предлагаемого техйического решения заключаются в следующем: прос 1 ота получения химически однозначно определенных коньюгатов антигена-катализатора в любых количествах, в противоположность другим конъюгатам одноразовое применение без многократного компрессования", высокая эффективностьи ч 1 чо и 1 п ч 11 го. Значительное сокращение лабораторных животных, зачастую даже полный отказ от иммунизации 1 п ч 1 чо и резкое уменьшение времени, в частности, при гентехнолоических работах. Опыты можно проводить также.с системами клеточных культур человека.Пример иммунизации 1 п ч 1 чо,ВаЬ/С-мыши в возрасте 6 - 10 недель были иммуниэированы путем одноразовой инъекции 1,р 50 микрограмм и 500 микро- грамм/0,2 мл 10 - 10 молярного раствора-гковалентно связанного с антигеном катализатора (РагпзСуэ - Яег/ЕО Р-В 515-529), В качестве контроля служили антиген, катализатор и смесь антигена и катализатора в сравнимых молярных количествах, атакже средах. Через две недели после инъекции у мышей была взята кровь из ретроорбитального венозного сплетения для получения сыворотки и определен титр антител опытом ЕОЯА.Аналогичную иммунизацию можно проводить другим путем. например, внутривенозно, орально, ректально, внутримышечно, подкожно.1823876 14 Последовательное построение пептида с симметричными ангидридами Евое - аминокислотыоов оа а 1 1 Составитель В. Волков Техред М.Моргентал дактор О, Стенина Ко р С. Пекар Заказ 2192 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 10 и затем полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп и выделениемцелевого продукта в виде трифторацетата.