Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста

Номер патента: 1471949

Авторы: Джозеф, Джон, Уолтер

ZIP архив

Текст

ССЮЗ СОВЕТСКИХццццццццсццкРЕСПУБЛИК 1471 94 С 12 М 15/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВСЕСОЮЗНАЯ ВЫ и 3 1 ЕЬ 11 ЩШ 1 Б 1 БЛИОТЕйА(71) Дзе Радкентс Офоф Колифорния (ОЬ)(56) Иероу Дж ,Уозит ДжА. Исследование Фибрионкн.: Рекомбинантные молние для науки и нцактик.англ. - И,фНаука, 197484. 1Изобретение относится к генной инженерии и касается способа получения рекомбинантной плазмидной ДНК,кодирующей бычий гормон роста.Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, получена путем выделения мРНК .из гипоФизарных желез быков с последующим получением кДНК и клонированием полученной кДНК в рВ 11 3212.П р и м е р. 1. Гипофизарии коров извлекают вскоре после умерцвления коров и сразу же замораживаот в :жидком азоте. Рибонуклеиновую кислоту (РНК) приготавливают путем гомо" генизирования гипофизариев в растворе тиоцианата гуанидина. Затеи РНК экстрагируют фенолом и осаждаот в этаноле, Полиаденилнрованную РИК очи, щают, используя метод адсорбционной(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЙАЙЖДНОЙ ДНК, . КОДИРУИЩЕЙБЫЧИЙ ГОРМОН РОСТА(57) Изобретение относится к областигенной инженерии и касается способаполучения рекомбинантной плазмиднойДНК, кодирующей бычий гормон роста,Рекомбинантная плаэмидная ДНК, кодирующая гормон роста быка, полученапутем выделения мРНК из гипофизарныхжелез быков с последуюцим получениемкДНК.и клонированием полученной кДНКв рВВ 322. 1 э.п. Ф-лю, 1 табл,2 хроматографии с применением олиго- дТ-целлюлоз ы.Полиаденилиров анную РНК транслируют в свободной от клеток суспен.зии используя ретикулоциты кролика. Предшественника гормона роста быков, синтеэированньв 1 в этой системе, жунн 9 осаждают с использованием гетеро- логической антисыворотки антиовечьего гормона роста и выделяют путем,адсорбции к Фиксированному формалиновому штамму 1.Соиап ЬарЬу 1 ососсцэ асгецз. 35, Й-белки подвергают элект- )Эв рофорезу на 12,5 Х 0 похщакриламцц"ных г.елях. Этот анализ показывает, что полианилированная РНК, кодирующая предварительный гормон роста быков, составляет примерно 12,63 от общей гипофиэарной полиаденилированной РНК, 1471949101520 Трансформацию Е. со 1 а Х,177 б плаз"мидой осуществляют как описано ниже. Штамм Е. со 1 д Х 177 б становится проницаемым для ДНК в результате выдержки в термостате в 75 мкМ СаСТ, 5 мкИ ИОСТ, 10 мкМ Трис, рН = 7,5 в течение 20 мин. при 4 С, Плазмиду и .бактерии выдерживают в течение 60 мин при 4 С и затем в течение 2 мин при 41 С, Преобразованные колонии отбирают ио стойкости к тетрациклину, Присутствие размноженной ДНК определяют путем гибридизации колоний кДНК зондом, меченным 32 Р и кодирующим гормон роста быков. Плазмнду ДНК выделяют из отобранных колоний, расщепляют Рз 1, подвергают электрофорезу на 17.-ной агарозе, обрабатывают этидийбромидом, фотографируют и, на- . конец, переносят на нитроцеллюлозные фильтры, Наличие последовательностей гормона роста определяют путем гибридизации с полной цепью кДНК гормона крысы, меченной пдсЕ-. трансляцией. Получаса один клон, который гибридизировался с пс 1-транслированной ЬБАи обозначенной как рВР 348. ВведеннаяПолиаденилированную РНК траскрибируют в одноцепочечную с ДНК с использованием обратной транскриптазы. РНК удаляют путем щелочного гидролиза. Одноцепочечную с ДНК экстрагируют фенолом, подвергают хроматографическому разделению при пропускании над 6-50 5 ерЬадех и осаждают этанолом. Одноцепочечную ДНК используют как основу для синтеза второй цепи кДНК с применением обратной транскриптазы. Одноцепочечнув "гепариновув петлю" у 3 -концевой части первой молекулярной цепи кДНК удаляют путем обработки нуклеазой Б. Двухцепочечную с ДНК очищают экстракци-ей фенолом, подвергают хроматографическому разделению при пропускании над 650 Берйайехи осаждают в этаноле. Двухцепочечнув кДНК снабжают концевым звеном дСМР с использованием ОСТР и концевой трасферазы.Плазмиду рВК 322 расщепляют эндонуклеазой Рз 1 и снабжают концевым звеном ЙСМР с тем исключением, что вместо ЙСТР используют ДСТР. 50 нг расщепленной Рзй 1 плазмиды рВК 322с йС-концевой частью и 20 нг двуцепочечной кДНК с ЙС-концевой частью отжнгают в 50 мкл реакционной смеси. йоследовательность включала 8831 пар оснований.П р и м е р 2. Плазмиду рВР 348расщепляют Рз 1, фосфат у 5 -концевых звеньев фрагментов ДНК удаляют путем обработки щелочной фосфатазойии заменяют меченным 1 Р 1 фосфатом с использованием полинуклеотидной киназы. Затем плазмиду рВР 348 расщепляют РзС Т, Рчи 11 или Бац ЗА, меченнымиАТР, и полинуклеотидной киназой, а после этого расщепляют другими ферментами с образованием фрагментов ДНК, меченых в одиночной концевой части. Эти фрагменты получают путем элюирования из полиакриламидного геля и устанавливают последовательность.Аминокислотные положения нумеруют, начиная с аминокислоты с аминовым концом гормона роста быков в направлении к карбоксильному концу и в направлении к первому АПС кодону, который, как предполагается, является точкой начала трансляции, Данная последовательность кодирует синтез гормона роста, включающий послетрансляционнув обработку. Трансляция гормона роста шКИА приводит к предшественнику гормона роста, включающему сигнальный пептид.П р и м е р ,3. (А) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, используя плазмиду рВК 315 вместо. плазмиды рВК 322. Все условия, включая отбор рекомбинантных клонов, описаны ранее.Введенную последовательность удаляют и анализируют аналогично примеру 2, в результате чего получают ДНК, содержащую примерно 831,п.о.(В) Осуществляют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, с использованием плазмиды рВК 316. вместо плазмиды рВК 322; Все условия идентичны описанным в примере 1.П р и м е р 4. В данном примере сДНА, кодирующувпредшественник гормона роста быков, получают по приме 1(А) Линкеры Нв 2 ТТТимеющие последовательно сть 5 -ССААССТТССсоединяют с кДНК, полученной по примеру 1, за счет связывания обрезанных концов с использованием .Т ПМА лигазы. После связывания продукт обрабатывают посредством Нпй 1 Т 1 или Нзц 1. Плазмиду рВК 322 расщепляют5 147Н 1 пй 111 или Нзц 1 и подвергают обработке щелочной фосфатазой. Послеосаждения из этанола обработаннуюфосфатазой расщепленную рВК Э 22 соединяют с кДНК, содержащей линкерНхпй 111. Е. со 1. Х 1776 трансформируют рекомбинантной плазмидой иотбирают по чувствительности к тетрациклину. Получают колонию, включающую введенную последовательность,которая гибридизируется с псЕ-транслированной ДНК, Введенную последовательность удаляют путем расщепленияс Нпс 111 или Нзц 1 и анализируют,как описано в примере 2. Введенная молекула содержала примерно 830 пар оснований. (В) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4, в котором использовалось несколько векторов вместо рВК322, однако вместо плазмиды рВК 322используют плазмиды рБС 101, рМВ 9,рВК 315 и рВК 316. Все условия, включая отбор рекомбинантных клонов, аналогичны описанным. Для всех плазмидполучаюе идентичные результаты, т.е.в каждом случае получают рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, кодирующую гормон роста быка,(С) Осуществляют процедуру такимже образом, как описано в примере 4(А), но используют несколько другихсайтов рестрикции и эндонуклеаз рестрикции. В данном примере используютлинкеры Ба 1 1 и Ваш Н 1 вместо линкеров Ндпй 111. Последовательностилиикеров представляют собой5 -ССТССАССи 5 -ССССАТСССС При использовании линкеров Ба 1 1кДНК и рВК 322 расщепляют эндонуклеазой Ба 1 Т, а при использовании линкеров Ваш Н 1 эндонуклеаза ограничения представляет собой Ваш Н 1, Всеусловия, включая отбор рекомбинантных клонов, описаны в примере 4(Э) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (С), в котором вместо плаэмиды рВК 322 используют плазмиды рБС 101, рМВ 9, рВК 313, рВК 315и рВК 316. Все условия такие же, какв примере 4 (С) и получают идентичныерезультаты.(Е) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4.(А) с использованиемлинкера Есо К 1, имеющего последовательность 5 -СССААТТ 6 С, вместолинкера Н.пй 111 и с использованиемэндонуклеаэы Есо К 1 вместо Нпй 111 19496(Нзц 1). Транформирование колонии неотбирают по чувствительности к тетрациклину,5(Р) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (Е), но с использованием плазмид рБС 101, рМВ 9, рВР313 и рВК 315 вместо рВК 322, Используют те же условия, что описаны в1 О примере 4 (Е), и для каждой плазмидыполучают идентичные результаты.(С) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованиемлинкера Рзй 1, имеющего последовательность 5 -ССТССАСС, и с использованием Рз 1 1 эндонуклеазы вместосайта Нжд 111 и вместо Нпй 1 Т 1(Нзц 1) соответственно. Используютидентичные условия с той разницей,что отбор рекомбинантных клонов осуществляют, как описано в примере 1Получают рекомбинантный клон.(Н) Осуществляют процедуру аналогично примеру 4 (С), но используют25 плазмиды рВК 315 и рВК 316 вместоплазмиды рВК 322. Используют те жеусловия, что описаны в примере 4 (С),и получают идентичные результаты.Я) Осуществляют процедуры такимЗ 0 же образом, как описано в примерах 13 (А), Э (В) и 4 (А) - (Н), с использованием Е, со 1 КВ.Т или Е. со 1 д НВ101 вместо Е. са 1 Х 1776Все условия и результаты идентичны описанным.П р и м е р 5. В данном примере получают сОНА, кодирующуюпредшественник гормона роста бьгков, как описано в прикере 1, Линкеры Есо КТ соединяют с кДНК и рас 4 щепляют посредством Есо ВЗ.(А) В качестве вектора используютСЬагоп 16 А. Когезионно связанные концевые части обрабатывают путем выцер -жки в течение 60 мин при 42 С в 0,1 МТрис-НС 1, рН щ 8,0 и 10 мМ МяСТ.Данный вектор расщепляют в сайте:Есо К 1 эндонуклеазой Есо КЗ и затемподвергают обработке щелочной фосфатазой. После осаждения из этанола вобработанный фосфатазой вектор ЬЕсоК 1 сайт вводят кДНК при молярном соотношении 2 моль вектора на 1 моль,Эту смесь сшивают лигазой фага Т 4.Полученной смесью трансформируют,суспензию клеток Е. со 1 1 Х 1776, приготовленную для преобразования, какописано в примере 1. Рекомбинантныефаги извлекают и наносят на .Ьас бак" терни в чашках, содержащих 5-хлор1471949-бром-индолилР-глактозид (Хб),для продуцирования,бесцветных негативных колоний отбирают рекомбинантные фаги (80 мкг/мл), содержащиесДНК в Е. соЮ сайте вектора СЬагоп16 А. Отобранный рекомбинант изолируюти обрабатывают избытком эндонуклеазы Есо Ю и продукт обработки анализируют, как описано в примере 2. Извлекают ДНК с длинной цепью, включающей примерно 830 пар оснований. Полученные фаги упаковывают п чегго.(В) ДНК фагов СЬагоп ЗА или 4 Аиспользуют в качестве вектора вместоДНК СЬагоп 16 А. Все условия былиидентичны тем, что описаны для ДНКСЬагоп 16 А. Выбор рекомбинантных фагов осуществляют путем нанесения фагов на Ьасф бактерии в чашках, содержащих Хб, и изолирования бесцвет-.ных негативных колоний с последующими либо гибридизацией с соответствующей пробой, или обработкой эндонуклеазой, Эту введенную последовательность удаляют, как описано ранее,в результате чего получают ДНК сдлинной цепью примерно 830 пар осно.ваний.(С) ДНК фага Ъ яг МЕЯЪВ используютв качестве вектора вместо СЬагоп 16 А,Все условия идентичны описанным дляСЬагоп 16 А, Отбор рекомбинантных фагов осуществляют по способу гибрщизации.Введенный фрагмент удаляют, какописано ранее, в результате чего получалась ДНК, включающая примерно830 пар оснований (длина цепи).(Р) Осуществляют процедуру такимже образом, как описано в примерах5(А) - (С), в которых использовалисьЕ, со 1 х КРЛ, Е. со 11 НВ 101, Е. со 11РР 50 или Е. со 1 ПРЯ иф Р, вместоЕ. со 1, Х 1776, Все условия идентичны и получают идентичные результаты.П р и м е р б. Для осуществления данного примера получают сДНК,кодирующую предшественник.гармонароста, как описано в примере 1. Вводят линкеры Нпй 111 и кДНК обрабатывают посредством Нпи 1 111 илиНзц 1, как описано в примере 4(А).Плазмиду рС 194, изолированнуюиз Б. ацгеце, используют в качествевектора, рС 194 расщепляют в зонеНпс 1 1 .1 посредством Нпй 111 илиНяц 1 и затем подвергают обработкещелочной фосфатазой,Полученную кДНК соединяют с расщепленной рС 194. Осуществляют трансформацив В. зцЬг 11 з КцВ. Клеточнуюсуспензию наносят непосредственнона Ь чашки, содержащие 3 мкг хлорамфеникола, Отобранный рекомбинантизолируют и обрабатывают посредством НиИ 111 и продукт расщепления 10 анализирувт, как описано в примере 2,Извлекают ДНК длиной цепи примерно830 пар оснований.П р и м е р 7. (А) ПлазмидурВК 348 обрабатывают эндонуклеазойНае 11 с образованием фрагмента,включающего 1600 п,о, Однако эонаНае 11 находится в пределах введенной кДНК, кодирующей предшественникгормона роста, а вторая зона - в 20 пределах фрагмента плазмиды рВК 322.. В результате расщепления получают4 15 -С ТТС ,33 -ССССАА ,525Бычий СН (гормон роста) начинается либо с +1 а 1 а, либо с .+2 рЬеостататочного звена в концевом по-.фложении Ж , Удаление кодона а 1 а 30осуществляют путем выдержки в термостате ДНК вместе с йАТР и фрагментомКленова ОНА полимеразы 1. В результате этой реакции получают.5 С ТТС,3 35 3 - ААС ,5ДНКэкстрагируют фенолом и осаждают. Избыток дАТР и,дигерированные основания удаляют путем хроматографиина С 50 БерЬайех. Оставшееся 5 звено 40 удаляют нуклеазой 8,. В результатетакого расщепления получают5 - ТТС 33 - ААС-5 45 (В) Осуществляют процедуру такимже образом, как описано в примере7(А), в котором деэоксинуклеотиднуюпоследовательность, кодирующую предшественника гормона роста быка, уда ляют путем обработки рекомбинантныхДНК, полученных в примерах 3, 4, 5и 6 эндонуклеазой Нае 11.Используемые векторы и эндонуклеазы показаны в таблице.55После обработки ферментом рестрикции изолируют последовательностьпредшественника гормона роста быкапосредством гельэлектрофореза и эа 9 147тем ее подвергают обработке, как описано в примере 7(А), при этом получают идентичные результаты,(С) Осуществляют процедуры такимже образом как описано в примерах7 (А) и 7 (В), с использ ованием Т ДНКполимеразы или 3 " 5 экзонуклеазывместо фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1.Все другие условия идентичны и вкаждом случае получают идентичные последовательности фрагмента гормонароста быков,П р и м е р 8, (А) фрагмент.гормона роста быков,5 - С ТТС 3(3 - ССССААС 5получают путем обработки Нае 11, какописано в примере 7(А) или 7(В), Затупление осуществляют следующим образом. ДНК,выдерживают в термостате.с ДАТР, ИСТР, ИСТР, ЙТТР и фрагментомКленова ДНК полимеразы 1. В результате этой реакции получают5. - СС СС ТТС ,33 - ССССААС , 5ДНК экстрагируют фенолом и осаждаютДанную последовательность затем выдержйвают в термостате с фрагментомКленова ДНК полимеразы 1 в присутствии ИСТР. Эту последовательность затем обрабатывают Я, нуклеазой, в результате чего получают последовательность5 - ССС ТТС 33 - ССС ААС , 5(В) Осуществляют процедуру такимже образом, как описано в примере8(А),. с использованием Т 4 ДНК полимеразы или 3 - 5", т.е. в присутствииВСТР.П р и м е р 9, Дезоксинуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста быков, вводят в векторы переноса, как описано для предшественника гормона роста быков.(А) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах 1, 3(А), 3(В), 4(А) - Я), 5(А) ,(Э) и 6, с использованием ДНК,приготовленной аналогично примерам 7 (А), 7(В) или 7(С). Все другие условия идентичны. ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами, как показано в таблице, и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае по 19491 О З 0 Иммунный комплекс осаждают и иэмеря 35 5 10 15 20 25 40 45 50 55 лучают ДНК с последовательностью, начинающуюся с РЬе в положении 2.(В) Осуществляют процедуры таким же образом, как описано в примерах 1, 3(А), 3(В), 4(А) - (.Г), 5(А) - (Р) и 6, с использованием ДНК, приготовленной согласно примеру 8(А) или 8(В). Все другие условия идентичны. ДНК расщепляют соответствующей эндо-. нуклеазой (как показано в таблице) и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае получают ДНК, имеющую последовательность, начинающуюся с А 1 а кодона.П р и м е р 1 О. (А) Экспрессию предшественника гормона роста быка как белка слияния демонстрируют с помощью радиоиммунного анализа и "миниклеточного" эксперимента. В эксперименте с радиоиммунным анализом Е. со 11 Х 1776, содержащие рВК 348, или Е, со 1, содержащие рВК 322, как контроль, выращивают в питательном бульоне и извлекают поСредством центрифугирования. Клетки повторно сус" пендируют и лизируют, и в гормон роста вводят радиомеченый гормон ростаовец и антитело овец (или быков). ют радиоактивность. Эксперимент показал, что белок слияния сохраняетнекоторую вчмуноактивность гормонароста быков. Для более подробной иллюстрации продуцирования белка слияния осуществляют "миниклеточный" эксперимент. Данный эксперимент показывает, что рВК 348 образует белок слияния, состоящий из 183 аминокислот-лактамазы, 217 аминокислот предгормона роста быка и несколько связывающих аминокислот, коированных обычно, нетранслированной 5 зоной. Общий молекулярный вес, составляющий примерно 45000, соответствует предсказанному молекулярному весу гибридного белка.(В) Дпя прямой экспрессии предшественника гормона роста быка введенную ДНК сначала отделяют от рВК 348 путем частичного расщепления эндонуклеазной Рай 1 и очищают посредством препаративного гель-электрофореза.15 мкг образца очищенной введенной ДНК затем модифицируют путем суспензирования ДНК в воде, в которую вводят раствор солей так, чтобы конечная композиция содержала: 70 лй 1 Трис,рН = 8,8; 70 мМ И 8 С 1, 10 мМ дитио147194 35 40 треитола и 13,75 молекулярных звеньев полимеразы ДНК в общем объеме 250 мкл. Реакционную смесь выдерживают в теромостате при 37 С в течение нескольких минут, затем вводят йАТР до концентрации 50 м 1. После. дополнительной выдержки в термостате в течение 30 мин фермент инактивируют путем термообработки при 65 С в течение 5 мин. Этот процесс повторяют еще два раза, один раз с использованием ИСТР и ИМАТР, а затем снова с использованием ЙТТР. Обработанную ОНА извлекают путем осаждения этанолом. Обрабатывают Б, нуклеаэой, Данный процесс обеспечивает получение молекулы ДНК, заканчивающейся в начальном кодоне в положении эа номером 26. Такие молекулы транслируются при вводе в вектор экспрессии, имеющий зону ввода, соответствующую примерно 3 - 11 нуклеотидам от последовательности рибосомного связы,вания.Вектор прямой экспрессии конструируют путем модификации плазмиды РГгр ЕЗО, путем удаления 23-29 нуклеотидов с использованием ТРНА полимера 1 эы и Б 1 нуклеаэы, как описано ранее. Модифицированную кДНК и модифицированный вектор экспрессии снабжаютлинкером, имеющим последовательность5"ССССАТССССу одной цепи, и гомологичную ей последовательность удругой цепи посредством связыванияс использованием лигазы. Эти линкерыобеспечивают наличие Ваш Н+ сайтов.Бактерии-хозяева Е. со 1 х НВ 101, ИВили Х 1776 трансформируют посредством рекомбинантных ДНК, несущих фраг 5 10 15 20 25 9 12те в течение 10 мин, Клетки извлекают путем центрифугирования, промывают и снова суспендируют в 250 мкл буферного раствора, содержащего 1 ОЕ гликоля, 5 Е Р-меркаптоэтанола и 2,3 Х БОБ в О,С 525 М Трис, РН = 6,8, Суспензию кипятят в течение 5 мин, затем вводят в 103-ный гель БРБ полиакриламида и фракционируют посредством элект" рофореза. Полосы, соответствующие белковым зонам, визуально наблвдают посредством ауторадиографии. Результаты показали наличие новой белковой полосы, составляющей примерно 24000 дальтон, которая отсутствует в неиндуцированных или непреобраэованных культурах.Предшественник гормона роста быков очищают обычными способами, включающими, например, гель-Фильтрацию, ионообменную хроматографию, адсорбционную хроматографию и методы, основанные на различии растворимостей, Предшественник гормона роста превращают в гормон роста.(С) Линкеры с последовательностью 5 "ССССАТССССАТСу одной цепи игомологичной ей последовательностью у другой. цепи соединяют фрагментом ДНК, кодирующим гормон роста, быка, полученным аналогично примерам 7(А) - (С) и 8(А) - (В). Эту модифицированную РБА затем вводят в вектор рог РЕ ЗО, как описано в примере 10(В), Бактерию-хозяина трансформируют и культивируют, и получаемый в результате гормон роста быков очищают, как описано в примере 10(В).Формула изобретениямент, кодирующий предшественник гормона роста, и трансформаты отбирают по стойкости к ампициллину. Единственный трансформант, обозначенный как рог РЕЗО/ЬСН отбирают для дополнительного анализа,Бактериальные клетки, трансформированные плазмидой рог РЕЗО/ЬСН, выГращивают в стандартной, минимальной среде (М 9), содержащей 1 е 11 РгО, витамин В 1 и ампициллин, при 37 С. На ранней логарифмической фазе Ггр оперон индуцируют путем ввода -индолилакриловой кислоты (30 мкг/мл среды). Контрольные культуры оставались неиндуцированными. По прошествии 3 ч роста 15 мл клеток, подвергают радиоактивному мечению путем ввода 20,мк С Б,-Ме 1 и выдерживают в термоста + 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийся в том, что выделяют полиаденилированную мРНК из гипофиза быка, очищают поли А мРНК адсорбционной хроматографией с применением олиго-й-целлюлозы, обрабатывают обратной транскриптазой и получают однкДНК, удваивают полученную однкДНК .с помощьв обратной транскриптазы, полученную двунитевую кДНК последовательно обрабатывают эндонуклазой Нае 11, фрагментом Кленова, ДНК полимеразой, а затем нуклеазой Б и получают кДНК, кодирующую бычий гормон роста с 26 по 91 аминокислоту со следующей нуклеотидной последовательностью;14 49 иклонируют еев Рай 1 или ЕсоК 1 сайтвектора рВК 322,25ЬФермент Вектор переноса (Пример)ог р аниче- ния 3 А, ЗВ, 4 С, 4 Н4 А, 4 В, 64 С, 4 П4 С, 404 Е, 4 Р 5 А, 5 В, 5 С Рай 1Нин 111Яа 1 1Ваш Н 1Есо К 1 Составитель Н. КузенковаРедактор Н. Лазоренко Техред Л.СердюковаКорректорС.Шекмар Заказ 1622/58 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 13 147195-АТСЛТСССТССАСССССССССАССТСССТССТССТСССТТТСССССТССТСТСССТССССТССАСТСАССТССТСССССССТТССС АСССАТСТССТТСТССССССТСТТТСССААСССТСТССТССССССТСАССАССТССАССАССТСССТССТСАСАССТТСАААСАСТТТСАСССТАССТАСАТСССССАСССАСАСАСАТАСТССАТССАСААСАСССАССТТСССТТСТССТТСТСССАААССАТССССССССССАСССССЛАСААТСАСССССАССАСАААТСАСАСТТССАССТССТТСССАТСТСАСТССТССТСАТССАСТССТСССТТСССССССТССАСТТТСТСАССАСАСТСТТСАССЛАСАССТТССТСТТТСССАССТСССАСССТСТСТАТСАСААССТСААССАССТССАССААСССАТСТТСССССТСАТСССССАССТССЛАСАТСССАССССССССССТССССАСАТССТСААССАСАССТАТСАСАААТТТСАСАСАААСАТССССАСТСАССАСССССТССТСААСААСТАСССТЦТССТСТССТССТТССССААССАССТССАТЛАСАСССАСАССТАССТСАСССТСАТСААСТССССССССТТСССССАССССАССТСТСССТТСТАС2. Способ по и. 1, о тлич аю щ и й с я тем, что двунитевую кДНК расщепляют Нае 11 эндонуклеазой полученные фрагменты инкубируют в 30 присутствии МАТФ, ЙГТФ, ЙЦТФ и ЙТТФ последовательно обрабатывают фрагментом Кленова, ДНК-полимеразой фага Т,или 3 -5 в присутствии йТТФ с последующей обработкой эндонуклеазойЯ и получением кДНК, кодирующей гормон роста быка со следующей нуклеотицной последовательностью 5 -СССТТСССАСССАТСТССТТСТССССССТСТТТСССААСССТСТССТССССССТСАССАССТССАССАССТСССТССТСАСАССТТСАААСАСТТТСАСССТАССТАСАТСССССАСССАСАСАСАТАСТССАТССАСААСАСССАССТТСССТТСТССТТСТСССЛААССАТССССССССССАСССССЛАСЛАТСАСССССАССАСАААТСАСАСТТССАССТССТТСССАТСТСАСТССТССТСАТССАСТССТСССТТСССССССТССАСТТТСТСАССАСАСТСТТСАССААСАССТТССТСТТСССАССТСССАСССТСТСТАТСАСААС

Смотреть

Заявка

3345603, 23.10.1981

Дзе Раджентс Оф Дзе Юниверсити оф Колифорния

УОЛТЕР Л. МИЛЛЕР, ДЖОЗЕФ А. МАРТИАЛ, ДЖОН Д. БАКСТЕР

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00

Метки: бычий, гормон, днк, кодирующей, конструирования, плазмидной, рекомбинантной, роста

Опубликовано: 07.04.1989

Код ссылки

<a href="https://patents.su/7-1471949-sposob-konstruirovaniya-rekombinantnojj-plazmidnojj-dnk-kodiruyushhejj-bychijj-gormon-rosta.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста</a>

Похожие патенты