Способ получения тетрапептидов или их кислотно-аддитивных солей

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСтМЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 1511 С 1 К 37 02 103/5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИОПИСАНИЕ ИЗО ПАТЕНТУ Я. - Туг - ЗА 1.а Ьюл, Джеселр Шуман энд К 07(08 1 опроп и метит ых солеи(57)общей бщей фор лучения СН - СОЯНгСН(72) Пол Дэвиди Роберт Теодо(54) СПОСОБ ПОИЛИ ИХ КИСЛОТНСпособ поформулы лчен.8)бке К. Пептидыс, 114.ТЕТРАПЕИТИДОВИВНЫХ СОЛЕЙ.тетрапептидов РЕТЕНИЯ где Р - водород, алкил алкил С - С., ц метил; Х - бром, хлор, йо или йх кислотно-аддитив о т л и ч а ю щ и й с я защищенный тетрапептидподвергают деблокированию при обработке трифторуксусной кислотой, 1082319Изобретение относится к способу получения новых биологически активных соединений - тетрапептидов или их кислотно"аддитивных солей, которые могут найти применение в медицине,Известен способ получения пептидов путем отщепления 7 р 0 7 -бутилоксикарбонильной группы от соответствующего блокированного пептида путем об О работки последнего трифторуксусной кислотой в присутствии аниэола при 0 С Г 1 .Цель изобретения - получение новых соединений, обладающих интерес ными Фармакологическими свойствами,Поставленная цель достигается способом получения тетрапептидов общей формулы - 2025 где- водород, алкил С-С, Й - алкил С -С, циклопропилметил;ЗОХ - бром, хлор, йод и метил, иди их кислотно-аддитивных солей, заключающимся в том, что защищенный тетрагептид общей формулы40 где"й , Я и Х имеют указанные значения, подвергают деблокированию при обработке трифторуксусной кислотой. 45Тетрапептиды Формулы(1 выделяют в виде кислотно-аддитивных приемлемых с фармацевтической точки зрения не- токсичных солей, которые включают соли органических и неорганических кислот, например таких, как соляная, серная, сульфо-, винная, фумаровая, бромистоводородная, гликолевая, лимонная малеиновая, Фосфорная, янтарная уксусная, зотная, бензойная, 55 аскорбиновая,-толуолсульфо-, бенэолсульфо- нафталинсульфо-р пропионовая и других. В описании использованы следующие сокращения; АЬи-о(-аминомаслянаякислота, А 1 а - алании, Суя - цистеин,Суя(Ме) - (Б-метил)-цистеин, Суя(Ме)(0) - (Б-метил)-цистеин сульфоксид,С 1 у - глицин, С 1 у(А 1) - аллилглицин,С 1 а(Ср) - циклопропилметилглицин,Няе - гомосерин, 11 е - И 30-лейцин, 1,ец - лейцин, Ме - метионин, Г 1 е(0)- сульфоксид метионина, Г 11 е - норлейцин, Г 1 уа - норвалин, РЬе - Фенилаланин, Бег - серин, ТЬг - треонин,Туг - тирозин, Ча 1 - валин, Ас - ацетил, АсОГ 1 е - ацетоксиметил, А 1аллил, Ср - циклопропилметил, Меметил, ЕС - этил, 1 р -иза -пропил,Рг - н -пропил, ОМе - метокси, Егп -этилтиометил, Р 1 е - 2-фторэтил,Ррц - пропаргил, Ви - н,-бутил,1-Вц - иза -бутил, с-Вп -трет -бутил,я-Вы -Втор -бутил, Вос в тр -бутилоксикарбонил, Вк 1 - бензил, Свкбензолоксикарбонил, ПСС - Г 1 Г 1 -дициклогексилкарбодимиид, НВТ - 1-оксибензотриазол, 0 МР - Г 1 Г 1-диметилформамид, ТРА - трифторуксусная кислота, ТНР - тетрагидрофуран, ПЕАЕ - диэтиламиноэтил, Г 1 ММ - Г 1-метйлморфолин, 1 ВСР - иза -бутилхлорформи.т, 18- -крон-1,4,7,10,13,6 - гексаоксациклооктадекан.Каждое иэ соединений формулыимеет заместитель в мета-позиции Феналаланина и, кроме того, любое из них или все они могут находиться в Форме приемлемой с фармацевтической точки зрения нетоксичной присоединенной соли кислоты.П р и м е р 1. Получение солиацетата Е-(Ч-метил)тирозил-аланил-глицил.-(Г 1-циклопропилметил)-мета-бромфенилаланин амида. А. гиповыи сложныи эфир Г 1-ацетил-р-циано-Р,-метабромфенилаланина.К суспензии 16,8 г (0,35 моль) гидрида натрия (50 Е-ный раствор в минеральном масле) в 260 мл сухого ТГФ при перемешивании при комнатной температуре добавляют небольшими порциями 59,56 г (0,35 моль) этилацет амидоцианоацетата, В реакционную смесь по каплям добавляют раствор 37,48 г (0,35 моль) метабромбензилбромида в 50 мл (сухого) ТГФ, Смесь сначала несколько охлаждают, а затем перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 72 ч, после чего дефлегмируют в течение34 ч. Смесь затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 80этилового спирта. Перемешивание продолжают еще в течение 30 мин, а затем вливают реакционную массу в 1 Браствор НС 1. Водную смесь экстраги"руют этилацетатом, слой этилацетатаотделяют и промывают последовательнводой, 1 Н раствором бикарбоната натрия и водой. Этилацетат сушат надсульфатом магния и концентрируют ввакууме до масла (107 г).ЯМР Ф:2,0 (ацетил), 3,4-3,5 (метилен) и 7,1"7,5 (мета-бромфенил),Б. Э,Е-Мета-бромфенилаланин.Продукт, полученный на стадии А(107 г, 0,32 моль, суспендируют врастворе 58,8 г (1,47 моль ) таблетогидрата окиси натрия и 220 мл воды.Полученную в результате смесь дефлемируют в течение 24 ч. Далее смесьохлаждают до комнатной температурыи ее рН доводят до 6,5 при помощи7 И раствора НС 1. Полученный и выпавший в осадок продукт собирают, сушаполучают 41,01 г ( 533) соединения.В, М-трифторацетил-Ю,Ь-мета-бромд.фенилаланин,К 200 мл трифторуксусной кислотыдобавляют 46,53 г (0,19 моль) П,Ь-мта-бромфенилаланина. Смесь охлаждают до 0 С и в течение 5 мин добаволяют 29,3 мл (0,21 моль ) трифторуксусного ангидрида, Полученный раствор перемешивают при 0 С в течениео1,5 ч и 3 ч при комнатной температуре, после чего реакционную массу коцентрируют в вакууме, Остаток раз"бавляют 400 мл воды и выпавший в осдок продукт собирают и сушат. Твердое вещество кристаллизуют из смеси6,простой эфир-петролейный эфир, полу 1082319 4гулируемой водяной ванны и рН 7,2 мл при помощи радиометра величины рН,.Раствор энергично перемешивают в течение 5 дн, затем рН доводят до 5,0добавляют углерод и смесь фильтруют.рН фильтрата доводят до 3,0 при помощи Ч НС 1 и затем фильтрат экстра" о гируют трижды зтилацетатом, послечего рН водного раствора доводят доО 7,0 при помощи 2 Х раствора НаОН ираствор концентрируют в вакууме доначала кристаллизации Ь-иэомера. Смесьохлаждают до комнатной температуры,выпавший в осадок продукт собирают,сушат, получают 10,9 г 1093 ) соеди"нения.Д л- трет"Бутилоксикарбонил-Ь-ме" к та-бромфенилаланин.В смесь 25 мл трет -бутилового г о спирта и 20 мл воды добавляют 9,9 г(0,041 моль) продукта со стадии Г,затем 20,5 мл (0,041 моль) 2 Н раствора ИаОН и 8,9 г (0,04 моль)ди-трет -бутил карбоната. Смесь перет,25 мешивают при комнатной температурев течение 5 ч, после чего добавляют150 мл воды и продукт зкстрагируютэфиром. Водный слой отделяют, подкисляют до рН 2,5 при помощи холодного е"ЗО 1 И раствора НС 1 и экстрагируют эфиром.Эфирный слой промывают водой, сушатнад сульфатом магния и упаривают ввакууме, Иаслянистый остаток растворяют в петролейном эфире и растворовыдерживают при 4 С в течение ночи.Выпавшие в осадок кристаллы отфильтн- ровыэают, сушат, получают 11,3 г, фенилаланина, охлажденной до 15 С.добавГ. 1,-мета-бромфенилаланин,Смесь 28 г (0,082 моль) продукта4 33 мл (О 33 моль ) иьо -бутил хлоое мп юполученного в стадии В, добавляют к формиата. Смесь перемешивают при -15 С500 мл воды, перемешивают, а затем к в течение 5 мин, после чего черезней добавляют 2 М раствор БаСН до по" реакционную массу в течениеч барлучения прозрачного раствора (РН 7 в 2) 55 ботируют безводный газообразный амДобавляют карбоксипептидазу А (25 мг миак ( газ ), Реакционную массу переи поддерживают температуру раствора мешивают еще в течение 4 ч при - 15 Сожают в течение ночи. Смесь затем вливают в 1 И раствор бикарбоната натрия,водный раствор экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу отделяют и 20 экстрагируют последовательно водой, 51,5 И раствором лимонной кислоты иводой. Затем этилацетат сушат надсульфатом магния и концентрируют ввакууме. Маслянистый остаток (1,6 г)растворяют в ацетоне и наносят надве препаративные пластины с тонкимслоем. Проявление ведут в смеси хлороформа и метанола при соотношении9:1, Основная компонента отделяетсяс пластин ТСХ и элюируется с силикагеля, получают 0,8 г (397.) целевого соединения.Л. Ацетотная соль Ф-метил-Ь-тирозил-Р-аланил-глицил-Ь-(И -циклопропилметил )-мета-бромфенилаланинамида,В 15 мл ТФК, содержащей 3 мл анизола, добавляют 0,8 г (1,2 ммоль )продукта, полученного в стадии К.Смесь перемешивают при 0 С в течеоние 30 мин, после чего сушат замораживанием. Полученное твердое вещество растворяют в 9,0 мл 0,1 М раствораацетата аммония, содержащего 31 Хацетонитрила. Полученный раствор 30хроматографируют на колонке с силикагелем (4 х 72 см). Колонку обрабатывают давлением 4,2 кг/см и элюатанализируют при 280 нм. Соответствующие фракции собирают и лиофили- З 5зуют, Полученное твердое веществорастворяют в 0,2 М растворе уксуснойкислоты (10 мл) и растворпропускаютчерез колонку с сефадексом (5 х 100 см)предварительно уравновешенную тем 40же растворителем. Злюат анапизируютв области 280 нм и соответствующиефракции собирают, лиофилизуют, в результате получают 773 мг ( 977)соеди"кения, (о(1 р +6 64 (с=0,5, 1 И НС 1) 45Злементчый анализ.Найдено, 7: С 54,30; Н 5,99;И 10,28.СН+ И,ОВг (662,2)Вычислено,: С 54,38; Н 6,09; 50И 10,57.Аминокислотный анализ, 7.: А 1 а 0,97с 1 у 1,031 Инз 0,99,П р и м е р 2, Ацетатная сольЬ-(И-метил)тирозил-Р-апанил-глицил-Ь-(И-этил)-мста-бромфенилаланинамида.(с)1 +1,18 (с=0,5, 1 М СН СООН )Элементный анализ,Найдено, 7.: С 50,00; Н 5,22;И 1 С,23С 2 Е И 501Вычислено Еф С 50 р 08 Н 5 у 5И 10,07.А иноки отный ана из 7: Ту,9925АТа 1 ю 011 С 1 У 0,99; ИНЗ 0,95.П р и м е р 9, Ацетатная соль1(И-метил)тирозил-аланил-глицил.(И-циклопропилметил )-мета-йодфенилаланнн амида.(оЦ 2 +0,787 д с=0,5, 1 М СН СООН,Элементный анализ,Найдено, 7.; С 50,50; Н 5,40;И 9,88.СН ОИ 507.1Вычислено, 7.: С 50,78; Н 5,68; З 56 9,81,Проведены биологические испытанияописываемых тетрапептидов.Болеутоляющая активность соединений формулы (1 ) установлена при фпомощи испытания на мышах с использованием горячей пластины, В этомиспытании применяют вертикальныйакриловый цилиндр, содержащий в качестве основания горячую плоскую поверхность, темлература которой поддерживается на уровне 52 С. Мьппамовводят подкожно заранее определенноеколичество испытуемого соединения,, растворенного или суспендированного 50в подходящем носителе, через 15 минпосле применения испытуемого соединения мышь помещают на горячую плоскук поверхность. Измеряют скрытоесостояние в секундах до прыжка мыши 55с горячей плоской поверхности, Агент,обладающий болеутоляющей активностьювызывает увеличение этого скрытогоТаблица 1 ЕБ , .г/кг Соединение по примеру 1,2 х 100,0030,00490,0030,00030,0018 0,0019 ФКроме того, соединения формулы 1) обладают низкой склонностью к физической зависимости. Этот факт установлен при помощи испытания, связанного с исследованием двигательной способности мышей. Была установлена высокая корреляция между степенью склонности к физической зависимости соединения и его способностью вызывать двигательную активность у мьппей.Двигательную активность у мышей измеряют при помощи цилиндрических клеток, изготовленных из проволоки, 5,08 см высотой и 28 см в диаметре, Шесть клеток помещают в звукоизолиро. состояния по сравнению с контрольной мышью, который был введен тольконоситель. Это может проявляться в .области доз, которые не вызывают потери моторной координации или способности двигаться.В табл,1 представлены величиныЕ 05 о, полученные в результате испытаний,ЕЭ 50 - величина дозы, которая вызывает болеутоляющий эффекту 507 испытываемых мышей ).Болеутоляющий эффект определяюткак реакцию скрытого состояния вприсутствии испытуемого соединения,которая больше или равна контрольнойреакции скрытого состояния плюс двастандартных отклонения, Эффект болеутоления в процентах рассматривают кахстатистическую величину и ЕР 5 вычисОляют методами регрессионного анализаданных доза-эффект, Каждая криваядоза-эффектдолжна иметь по крайнеймере четыре точки и каждая точка определяется с использованием данных,полученных для по крайней мере десяти обработанных мышей и десяти контрольных мышей,10823 11ванную снабженную вентиляцией каме ру с равномерным освещением. Луч света проходит через центр клетки к фотоячейке, расположенной на противоположной стороне. Две мыши поме" щают в каждую клетку на 1 ч с целью акклиматизации к окружающим условиям, Затем пяти парам мышей подкожно вводят определенное количество испытуемого соединения, оставшаяся пара 10 обрабатывается соляным носителем, не содержащим испытуемое соединение,7-д дФ,/,1,г),1 Я,уу Т а б л и ц а 2 Доза мг/кг 1 1 118 16 32 64 128 2388 3767 2807 4477 3476 613 819 148 304 796 1978 1092 2820 200 512 2523 ф 5153 1888 2159 630 2871 323 3852 42 235 358 701 140 320 171 276 м-) 174 363 852 178 1176 537 173 255 м-Ме 704 1204 2916 3528 431 1425 2415 2033 М Известные соединения. Иэ табл.2 видно, что по сравнениюс известными соединениями соединения Составитель В,ВолковаРедактор И,Николайчук Техред Л,Коцюбняк Корректор А.Тяско Заказ 1578/54 Тираж 410 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Н Е 1 Ме Е 1 Н Ег Ме Ег Ме Срм Н Ет Ме Ег. Н Е 1 Ме Ег м-С 1 м-С м-Вг м-Вг м-Вг 9 12Затем мьппей возвращают на 3 ч в соответствующие им клетки. Записываетсячисло показаний счетчика эа каждые15 мин, а также общее число эа трехчасовой период. Каждое прерывание луча света изменяет показание счетчикана единицу.В табл. 2 приведено среднее значение общих чисел для каждой группы из десяти мышей с использованиемконкретного соединения и определеннойдозы,в г формулы 1 ) обладают существенно более низкой двигательной активностью.