Способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз

О П И С А Н И Е (1 ц 935121И ЗОБевЕТЕ Н ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Соиаз СоветсиикСоциалистическиеРеспублик(6 ) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 16. 08. 79 (21) 2818834/13с прясоелинением заявки Рйдв делам изебретеиий и етерытийДата опубликования описания 15.06.82 н ь, НН.Л) Авторы изобретен я 1 аучно-производственное объединение Биохц. и Институт микробиологии АН СССР(71) Заявители 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТАДЛЯ АфФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ИИКРОБНЫЛИПАЗ Нед ляютс натри биаль кими ками, Изобретение относится к химической и микробиальной промышленности, в частности к получению биоспецифических гидрофобных сорбентов, применяемых для выделения липофильных ферментов,5 в. частности липаз.Липазы находят применение в пищевой и медицинской промышленности, в производстве моющих и косметических средств.Известен способ получения сорбента для аффинной хроматографии микроб-. ных липаз, который заключается в присоединении лиганда к нерастворимой матрице пу 1 ем обработки последней" ВгСМ-активированной сефарозы 4 В - алифатическими аминами 1. статками известного способа явиспользование полисахаридной ы, легко подвергающейся микрое 1 му заражению, обладающей низидродинамическими характеристи- . а также недостаточная гидрофоб" ность получаемого сорбента, в связи с чем степень очистки при использовании данного сорбента составляет 2- 5 раза.Известен также способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице в результате обработки органического материала, например агара хлорангидридами жирных кислот. Реакцию проводят в пиридине или смеси с ацетоном 1: 1) в течение,10-12 ч. Дости" гаемая степень очистки при использовании данного сорбеита 9-11 раз 23,Недостатком этого способа является то, что он не способен обеспечить получение сорбента с достаточно высокой гидрофобностью, обеспечивающей эффективность аффинной хроматографии липаз.Кроме того, общим недостатком описанных способов получения сорбентов является то, что используются орга 935121 445 0 55 нические матрицы, которые имеют свойственные таким материалам недостатки:низкую стабильность, подверженностьк микробиальному заражению, неудов.летворительные гидродинамическиехарактеристики вследствие сжимае-.мости полисахаридных матриц.Это не позволяет достигать высоких результатов при использованииданных сорбентов.Целью изобретения является повышение качества получаемого сорбента,т.е, повышение гидрофобности, стабильности, улучшение эксплуатационных характеристик сорбента,Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения сорЬента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающему присоединение лиганда к нерастворимой матрице, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром,который предварительно обрабатываютэпоксидной смолой в количестве 130 вес,Ф с последующим ее отверждением 3-53-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии триэтиламина при 90-95 оС и активациейполученного продукта обработкой5-201-ным раствором гексаметипендиизоцианата при 105-110 ОС, а присоединение лиганда осуществляют обработкой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом угреродных атомов 5 -10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:3-6)и температуре 100-105 оС,Предлагаемый способ обеспечиваетполучение сорбента высокой гидрофобности, созданной как присоединениемалкильной группы, так и полимернойпленкой на поверхности силохрома.Получаемый сорбент обладает такжевысокой механической прочностью,стабильностью, высокими гидродинамическими характеристиками,После введения алкильных групппервичными насыщенными спиртами всостав сорбента входят только те ио"низирующиеся вторичные аминогруппыкоторые образовались в результатеактивации гексаметилендиизоцианатом. Общую гидрофобность полученного данным способом сорбента повышают также гидрофобные участки молекул эпоксидной смолы и отвердителяполивинилового спирта, который после активации гексаметилендиизоциа 5 о 15 20 25 30 35 4 О натом содержит полностью гидрофобную цепь. Наличие алкильных групп,а также гидрофобных групп эпоксидной смолы и поливинилового спирта подавляет электростатическое действиевторичных аминогрупп. Это обеспечивает селективную адсорбцию липазна данном сорбенте, которая основана на гидрофобных взаимодействиях,и в результате повышает степеньочистки фермента, Выбранные параметры стадий синтеза обеспечивают.наиболее оптимальное протекание всехреакций,Способ заключается в следующем.В колбу загружают силохромудельная поверхность 45-60 м/г, среднийдиаметр пор 1000-1300 Я ) и растворэпоксидной смолы в ацетоне. Системуподключают к вакууму на несколькоминут для удаления воздуха из порносителя; После выпаривания растворителя добавляют 3-54-ный водный раствор поливинилового спирта в соотношении массы силохрома к массе раствора 1:5-10 и триэтиламин до концентрации его в растворе 1-24. Смесьперемешивают на водяной бане при 9095 фС в течение 1 ч, Фильтруют ипромывают горячей водой и ацетоном.После высушивания добавляют 5-204"ный раствор гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле в соотношениимассы силохрома к массе раствора1;4-6. Перемешивают при 105-10 ОСв течение 1 ч. После Фильтрования ивысушивания добавляют соответствующий спирт в соотношении масс твердой Фазы и раствора 1:3-6. Перемешивают в течение 1 ч. Фильтруют,промывают и сушат,Использование получаемого предлагаемым способом сорбента позволя-, ет достичь степени очистки липаз в 13-23 раза.П р и м е р 1, В колбу загружают 20 г силохрома и раствор 0,2 г эпоксидной смолы в 70 мп ацетона. Сис" тему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор силохрома, После выпаривьния растворителя на ротационном испарителе добавляют 100 мл 33-ного водного раствора поли- винилового спирта, 2 мл триэтипамина и нагревают на водяной бане при 90- 95 ОС в течение 1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат, К полученному продукту добвв21935ляют 80 мл 53-ного раствора гексаме-тилендиизоцианата в сухом толуоле иперемешивают при 105 С в течение 1 ч.Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном %шкафу, Содержание изоцианатных групп0,06 мг-экв/г силохрома.Активированную основу загружаютв колбу с 100 мл амилового спирта иперемешивают при 105 ОС в течение 1 ч, 1 вФильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп околоО, 05 мг-экв на 1 г сухого сорбента.Так как алкильные группы не поддаются прямому определению, их со%держание определяется из расчета,что степень превращения изоцианатных групп в .алкильные группы составляет около 80/.П р и м е р 2. В колбу загружают . 2 в20 г силохрома и раствор ч г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 миндля удаления воздуха из пор силохрома. После выпаривания растворителя 25добавляют 200 мл 5 Г-ного водногораствора поливинилового спирта, 2 млтриэтиламина и нагревают на водянойбане при 90-95 оС в течение 1 ч. Фильтруют, промываю 1 горячей водой, аце- звном и сушат.К полученному продукту добавляют120 мл 203-ного раствора гексаме 1 илендиизоцианата в сухом толуоле иперемешивают при 105 ОС в течение 1 ч. зФильчруач, промывают на Фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильномшкафу. Содержание изоциана 1 ных групп0,16 мг экв/г.Ак 1 ивированную основу загружают щв колбу с 120 мп октилового спиртаи перемешивают при 105 оС в течение1 ч. Фильтруют, промывают этаноломи сушат . Содержание октиловых группоколо 0,13 мг-экв/г сорбента.П р и м е р 3. В колбу загружают20 г силохрома и раствор 6 г эпок"сидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 миндля удаления воздуха из пор силоЗОхрома. После выпаривания растворителя добавляют 200 мл 53-ного водил;го раствора поливинилового спирта,2 мп триэтиламина и нагревают на водяной бане при 90-95 оС в течениеИ1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат,К полученному продукту добавляют120 мл 0-ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 11 ОвС в течениеч. Фильтруют, промывают на Фильтре толуолон и сушат в вакуум"сушильном шкафу. Содержание иэоцианатных групп 0,21 мг"зкв/г.Рктивированную основу загружают в колбу с 60 мл децилового спирта и перемешивают при 05 оС в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат, Содержание дециловых групп около 0,2 мг-экв/г сорбента.П р и м е р 4. 20 г активированного силохрома по примеру 2, содержащего 0,16 мг-экв/г иэоцианатных групп, загружают в колбу с 120 мл амилового спирта и перемешивают .при 100 оС в течение 1 ч. фильтруют, промывают этанолом и сушат, Содержание амиловых групп около О, 13 мг-экв/г сорбента.П р и и е р 5. 20 г активированного силохрома по примеру 2, содержащего О, 16 мг-экв/г изоцианатных групп,загружают в колбу с 80 мл дециловогоспирта и перемешивают при 1.05-110 С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловцх группоколо 0,13 мг"экв/г сорбента.Результаты присоединения алкильных групп к матрице приведены в таблице. П р и м е р 6К 800 мг сорбента с октилоеыми группами добавляют 6 мг Фернентного оаствора липазы 725 ед.7 в 0,0 И Фосатном буфере. Смесь оставляют при 2 ООС на 2 ч, периодически встряхивая, после чего частицы носителя с адсорбированнсй липазой отфильтровывают, помещают в колонку 10 мл в диаметре ) и промыва" ат буфером до исчезнования белка в промивных водах. В фильтрате определяат липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Зоури в модификации Хартри. Количество адсорбированных белка и активности определяют по разности содержания белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделения частиц носителя с адсорбированным белком. Адсорбированный белок элюируют 15 мл504-ого раствора этиленглихоля и15 мл 0,53-ного раствора дезоксихолатана 1 рия. Элюирование тритоном х проводят в условиях непрерывногоградиента концентрации 0,01-0,23)150 мл. Получают увеличение удельной активности (степень очистки ) в 23 раза ь наиболее активных фракциях, выход активности составляет 2 "ь.П р и м е р 7. К 100 мг сорбента с.дециловыми группами добавляют 2 мл ферментного раствора (96 ед,) в 0.,01 М фосфатном буфере рН 7,6). Условия адсорбции и десорбции такие ае, как в примере 4. Выход фермента 814 от активности исходного матриала, увеличение удельной активности в 20 раз в наиболее активных фракциях,Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа состоитв улучшении качества получаемыхсорбентов - повышении гидрофобности,стабильности и других характеристик,что позволяет достигнуть высокихстепеней очистки липаз. Липазы высокой степени очистки находят широкое применение в народном хозяйстве: 1 о. медицине, в производстве моацихи косметических средств, в пищевойпромышленности.Предполагаемый экономический эфФект от внедрения способа составит 15 около 100 тыс.руб.93512 2 Составитель О.СкородумоваТехред И.Надь" Корректор И.Иуска Редактор О.Персиянцева Заказ 4095/11Тираж 734ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, ЖРаушская наб., д.4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 1Формула изобретенияСпособ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице, о т л и ч а ю- % щ и й с.я тем, что, с целью повышения гидрофобности, стабильности, улучшения эксплуатационных характеристик сорбента, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, 10 который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 1- 30 вес.4 с последующим отверждением ее 3-5-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии три з этиламина при 90-95 ОС и активацией полученного продукта обработкой 5204-ным раствором гсксаметилендииэоцианата при 105-110 оС, а присоединение лиганда осуществляют обработкой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом углеродныхатомов 5-10 при весовом соотношечииматрицы и спирта 1:( 3-6) и температуре 100-105 оС. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент США Р 4013512,кл.195-66, 19772. Патент США Р 3901763,кл, 195-66, .1975.