Способ получения антибиотика 17. 967

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советскйх Соцйалйстйыескйх Республйк11) 544385 б 1) Дополнительный к пат У -2) Заявлено 13,05.69 (21) 1330012/ Кл. с 12 32) оритет -13.05.68 Фрасссш Государственнысй намитет Совета Министров СССР па делам изабретений и атнрытий) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНХИБИОГИКА 17,967 ВР к микробиологической 51 гертопсусев гообразует короткиезакручивающиеся успирали, Эти спороновоздушного мицелияволокон,но чаще в виовальные, их размер0,6 - 0,8 р. ЯтгертоптуОЯ 20.073 обладает сво0 ниновый черный пигме Изобретение относ промышленности.Целью изобретения биотика 17,967 ЯРобла активностью по отноше я е анти ется получе го антибакт ль даю нию ктериям различи идо отика 17,9сз 1 с ер.о3430) кульной сред тиб зания ато шта0,073ях на пи усеВтивируютсодержае соли,ИВВ также на большом набосред, кроме того онно-коричневый пигме тате сераль ода, азо нт ев ем и очисткои цмами,еленими при ных синтетических средах. Цвет спороносящего15 воздушного мицелия розовый. 17.967 В Продуцент антибиотиканадлежит к роду ЗтгертоптусеаБтгертотусеа штамм 05 20Го описан в коллекции департаства в Пиории (США) под номе риКультуральные признаки и биосвойства Ятгертоспусеа гоаеорссПатоа05 20.073 указаны в табл. 1. Эти признны на стадии их наибольшего развитияоельного выдержтсвания при 26 С. мическиештамм и приведе. 073, образеента сельскром МВВ 1. 3бразцов. которого хозяй выдеен из бразильских почвенных Способ получ ключается в том, ч говеорсс 11 атоз 05 2 в аэробных услови щей источники угл с последующим в продукта известнь Иностранцы ениз Манси, Леон Нинет и Жан ПредоИностранная фирмаСосьете Дез Юзин 11 имик Рон-Пуленк" (Франция) аеорсс 1 атоа штамм 08 20.07скороносящие волокна, ерхушки в одну или две сцы включаются в волокна иногда в виде отдельных де коротких гроздьев. Спорыприблизительно 0,4 - 0,6 и сея гоаеоро 11 атоа штамм йством продуцировать мела тт на средах с тирозином, а ре различных органических образует растворимый темна некоторых агаризован.544385 Среда дплкультивирования Резни члена. Серо-розовыйно раэвитъш Субетратныи. кто-желтый Агар Греенераи Хикеи (Л) рошее Агар ( же Быи Агар с прож.жевым зкстрактом Придхема Субстратньтй, желторичневый во се" Темно. коричневый Белый с рым, хо чер ныл Коричнево-желтыи тпое Вегетативный, кори вевожелтый, умеренно- разви- Тый Питательныйгар (фз) гетативттьй, ч ств Орнмость мв та альпин: рас. оряется, но мед. ое Вегетатнвньлт, бесцветньтн желтоветьа 3, умеретпго развитый Агар с малатом Умер кал. дя Краиикога ГГ) о ко.Серовато желтьо- слегка розовый слабо развитый Умеренн Субстратиый, оранжрнчневый с коричневчерным Агар с яичиьалъбумииомКоричнево. оранжевый, переходящиив коричнево черный реино развитьти Овсяный агарс томатной пас.тои Придхема (СГлюкозопепто.новый агар (Фе 1 Агар с тирози С ном и дроиокевым экстрактом для выявления мелатпои обре зоваютя (Е) тзтиовми агар1 В,)Глидерииоаспаргииовый силь. Желто коричневый.Споры овальные,переходяший в размером 0,4-0,6черный 0 08,спороиосцы образуютспирали и распопгаются в виде ко.ротких гроздьев Субстратиый, желто ко Розовато - серый, свет- Желто-кориптевьтиричневый пый, средне развитый переходящий вчер стуаптьтй, желто-ко. Розовато. серый, хо- Желто. коричневый,ИЧНЕВЫй рашо развитый почти коричневый ичнево Сероватый, умерен. Черный, обильный но развитый Черный, обильный Образование мелапродуцируется сра- нина: положитезу в начале культи. иоевиров анни544385 Продолжение табл. Наблюдения ибиохимическисвойства Серо.ко слабый ее Субстратиый, коричнево- Розово-сероватый желтый хорошо развитый Агар с крах.малом и мине ьными соля ми Придхема в Белый с серовато-бе Коричневатый лым, умеренно раз- витый Агар с крахмаом и нитрато идролиэ ла по ло.розовый до се. Черный глубокийваго розового, хошо развитый Хоро Субстратный, цвета красного дерева с коричневым,переходящий в коричнево.черный Синтетическиигар Гаузе (Н) Синтетический Тоагар Чапека ссахарозой (Ф 1 ) Вегетативный,коричнево.желтьй емно.коричневый Серовато белый со етлым сероватожелтым, умеренно развитыйтинный, коричнево- , светлый с темно. вым, очень хоро. итый. Синтетическийагар Чапека с глюкозой (1) т вокормчие Бульо Беловатый весьмаумеренно развитый Покров достаточно хорошо развитый, субстратныижелто - коричневый . Реакция на нитритыположительная к ом и ннтра ом (Э,Б Чапе Умеренн) Развивается в виде беловатых хлопьев зой (Э положительная наповероседает в на чапе культнвнро.делается очеотрицатель.ной Бульо Чапекаозой не наблюУтилизация целюлозыотрицательная меренное Серовато-бе Нет Темно-коричневый Реакция на нитритыотрицательная в ходе та Весьма Субстратньщ, желт умеренное со светло коричне й Споры овальные размерои 0,4 - 0,6 и 0,6 - 0,8 д, спороносцы образуют спирали и располагаются в виде коротких гроздьев крахмала, гидролиз продолжи.тельный культивирования;пробы брались соот.ветствеино через24 час,43 час,днев,15 дней и 1 мес. культнвирования11 ро,должение дбл. Наблюдения ибиохимическиесвойства Внешний вид воз.душного мицелияи споронасцев Среда длякультивирования Развитие Мицелий Пигментация Черный глубокий Хорошее Вегетативный желтовато серый с коричнево-черным, оченьхорошо развитый Кулыивирование на карто. Феле (Вг 4 Серовато-белыйс серо- розовым,очень слабо раэ.витый Чистьй 12% иый/желаин Вегетативныйразвивается на поверхности, коричнево.жел.тый Хорошее Нет илисеровато-белый в виде следов Агар Треснераи Данта (М) Вегетативный, черный,хорошо развитый То же Нет Обезжиренноемолоко (1 Ч)при 25 С Хорошо развитыйвенчик Нет Полная пептониэация без коагуляции,рН не меняется втечение месяца Обезжиренное Очень Очень хорошо развитый Нетмолоко при хорошее венчик, коричнево-жел 37 С Полная пептоннзациябез коагуляции, РНне меняется в течещпмесяца шегося в процессе культивирования продукта. Культивирование осуществляют любым методом аэробного культивирования, поверхностного или глубйнного, но предпочитают глубинное.Среда для ферментации должна содержать источники ассимилируемых азота и углерода, минеральные вещества и иногда факторы роста, причем все эти компоненты вводят в виде отдельных веществ или в виде сложных смесей,В качестве источника ассимилируемого углерода используют такие соединения углерода как глюкоза, мальтоза, декетрин, крахмал или другие органические вещества, например, спирты, глицерин, манонитол или органические кислоты (молочную, лимонную), Некоторые животные и растительные жиры, например, свиной жир или соевое масло, могут заменить эти источники углерода или дополнить их.Источниками ассимилируе мого азота могут быть минеральные или органические соли аммония, мочевина, некоторые аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие азот, главным образом, в белковой форме: казеин, лактальбумин, глютен и их гидролизаты, соевая, арахисовая, рыбная мука, дрожжевой, мясной экстракты, кукуруза, раство. римые мелассы.Добавляют также минеральные вещества, которые обладают буферным или нейтрализующим дей. ствием, например фосфаты щелочных или щелочно. 10,5 кг/л)45(раствор в диметилформамиде, концентрацияМаксимум поглощения при268 нм В растворе д 1 метилфор 1 мамида его оптическое )бб вращение равно й) г,о = +103 (С=0,5) .Способ получения антибиотика 17.967 ЯР состоит в культивировании Ятгертопдусез гозеордд 11 атоз ОЗ штамм 20.073 или его мутантов на среде в соответствующих условиях и выделении образовав. б 0 Коричнево. желтый Превращение в жнд.коаь: преврацгается,но медленно Черный глубокий, Образование Нг 8:образуется сразу положительнов начале культи- вированияземельных металлов или карбонаты кальция имагния.Хлориды и сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов обеспечивают ионное равновесие, необходимое для развития 5 тгертотусез гоаео. -ро 1 а 1 иа штамм О 3 20.073 и образованияантибиотика.Соли цинка, мели, кобальта, марганца действуют как активаторы.рН ферментационной среды в начале культиви.рования должно быть в пределах 6,0 - 7,8, предпочтительно 6,5 - 7,5. Температура фермента.ции 25-30 С. Аэрация 0,3-3 л воздуха на 1 лбульона в 1 мин, Максимальный выход антибиотика 17,967 ВР получают через 2-8 дней культивирования.Антибиотик 17,967 ВР выделяют из сусла рас.творителями, несмешивающимися с водой, такимикак алифатические спирты, например этилацетат,хлорированные растворители, например дихлорэтан, хлористый метилен или хлороформ.После фильтрования и декантации сырой про.дукт выделяют из органических растворов концентрированием этих растворов при пониженномдавлении и последующим высаждением каким-либорастворителем, совсем нерастворяющим веществоили плохо его растворяющим, например гексаном,Грязный антибиотик очищают перекристаллизациейили хроматографией на различных адсорбентах.Методы экстракции, выделения и очистки антибиотика могут быть повторены многократно с цельювыделения этого продукта в форме, пригодной купотреблению,П р и м е р 1. В ферментер емкостью 350 л за.гружают 5 кг кукурузы (50%-ный сухой экстракт); 7,5 кг крахмала (частично гидролизованного) водопроводную воду добавляют до 220 л, рНдоводят до 6,85 450 ми 10 Н соды. Среду стерииэуют барбатированием нара температуры 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объембульона 250 ли рН 6,85, Затем засеивают 200 мл культивированного в колбе Эрлекмейера с перемешиваниемБйгерйоптусеа гозеорцатоз штамм ОБ 20.073Культура развивается при перемешивании иаэрации стерильным воздухом при 27 С в течение 27 час, После этого оца становится пригоднойдля эасеивания с целью получения антибиотика.Получение антибиотика производят в ферментере емкостью 800 и, загруженном следующими веществами:Растворимые мелассы, кг 7,5Кукуруза (50%-цый сухой экстракт), кг 10Соевое масло, и ,10Хлорид кобальта гексагидрат, г 10Водопроводная вода добавляется до, и 450рН доводится до 7,25 с помощью 1800 мл 10Н содызатем добавияюг 2,5 кг карбоцата кальция.Стерлизуют среду барботированием пара темпе.ратуры 122 С в тецецие 40 миц. После охлажденияобъем бульона около 490 л. Его доводят до 500 л добавлением 5 л стерильного водного раствора,содержагцего 2,5 кг церелозы и 5 л стерильноговодного раствора, содержащего 1 кг сульфата ал.моция. рН среды тогда становится 7,О,Затем засевают 40 и ицокулята, полученного вфермецтере на 350 л как описано вьппе. Куиьтиви.ровацие проводят при 27 С в течение 138 ч приперемешивании с помощью турбицы, делающей175 об/мнн и аэрации пропусканием стерильного воз.духа со скоростью 20 м час, рН среды становится 7,40, а объем сусла 450 л. Коиицество ацзибиотика 27 ед/см.П ри ме р 2450 л сусла для ферментации,полученного в условиях примера 1 и имеющеготитр 27 ед/см, помешают в чан, сцзбжеццый пере.мешиваюгцим устройством. рН сусла иоволят до7200 см 5 Н соляной кислотой, Е 1 обавляют затем 400 л этииацетата и перемегццван 1 гчас. Зател 1добавляют 50 кг вспомогатсиьцого агента лияфильтрования и суспецзию фииьтруюг ца фильтрепод давлением, Осадок промывают 00 и этциацета.та, а затем 100 и воды. Фииьтрат и цромынцыеводы, объем которых 1000 и, декацтируются. Органическую фазу отделяют, се обьсм 390 и. Нижнийвотшый слой, обьем которого 610 и, отбрасывают,органццеский экстракт промывают 100 и волы цпромытый экстракт отделяют о 1 водцото слоя.Промытый органический экс 1 рак коццецтрц.руют при пониженном дависццц (э 0 мм Н 9)при 27 С до объема 3 л.Концентрат разбаиияют 30 и ексаца. Ацтибиогик высаживают, отдеиянп фциьтроваццем. иромы.овают гексацом и сушаг при 40 С при цоц жеццол 1давлении (5 мм Нф. Получают таким образом 31 ггрязцога 17.967 ВР, именицего актцвцость 244 ед/мг,П р и м е р 3. 47 г продукта, поиуцеццого, какописано в примере 2, расгворяюг прц иеремешнвацни в 1 и диметилформамила. Поиуцеццьй растворфильтруют. Затем медиеццо добавияют при перемешивациц в течение 4 цас 1,5 и смеси мезацои-вода(50 - 50 об,%), чтобы вызвать кристаллизацию 17.967 ВР, Кристаллы фильтруют, промываютсмесью 0,3 л метанол-вода (50 50 об.1-) ц 0,2 лацетона, затем высушивают в течение 15 часпри 50 С в вакууме (5 мм Нф. Получают 8,7 гкристаллического продукта, имеющего активность 600 ед/мг,П р и м е р 4. 8,4 г продукта. полученного попримеру 3, растворяют при перемешивации в 250 мидиметилформамила. Получеццый раствор наносят на хроматографическую к оиоцку, содержа.щую 120 г силикагеля Мерка, пропитанного смесьюдиметилформамид.ацетон (50- 50 об.5). Сииикагель промывают 500 мл смеси дцметииформами.да-ацетоц (50 - 50 об.%). К фракции, окрашеццой вжелтый цвет (прибиизцтсиьцо 500 ми, содержащей 17,967 ВР), добавиянт 500 ми смеси метанол.вода (50 - 50 об 5.), которая вызывает кристаллизацию 17,967 ВР. Кристаллы фциьг 1 унл, промывают 150 мл смеси лгетацои-воиа (50 50)ц 100 мл544385 Составитель С, МалютинаТехред 3. фанта Редактор А, Бер Корректор Б. Югас Заказ 76 О/75 Тираж 541 Подписное ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фь ЪЬц"ь:.11ацетона. 11 родукт высупгиваню в ьтечер 1 е 15 часпри 50.С в вакууме (5 мм Н д), Таким образомполучают 5,74 г 17.967 ЯР, имеющей активность880 ел/мг,П р и м е р 5, 21,7 г продукта, полученного попримеру 4, растворяют прн перемешивании в600 мл диметилформамида,Раствор фильтруют, затем медленно в течение4 час при медленном перемешивании прибавляют 1200 мл смеси ацетон. вода (50 - 50 об.%), чтобывызвать кристаллизацию 17.967 ЯР, Полученныекристаллы фильтруют, промывают 200 мл смесиацетон-вода (50-50 об,%) и 200 мл ацетона, высу.шивают в течение 15 час нри 50 С в вакууме (5 ммН д), затем в течение 8 час при 50 С при 0,5 мм Нд,Получают 18,2 г 17,967 ЯР (чистого), имеющего активность 1000 ед/йг,й риме рб. 20 г продукта, полученного попримеру 2, и имеющего активность 195 ед/мг, растворяют в смеси ацетон-диоксан-вода (10 - 3 - 1 об.%)Полученньпт раствор фильтру 1 от для отделения 6,5 г нерастворимого осадка. К раствору добавляют 200 г снликагеля Мерка и упаривают досухана роторе, получая 17.967 ЯР, нанесенный на снликагель, Готовят колонку из 1 кг силикагеля Меркас помощью хлороформа (Ь = 51 см и д = 7 см) ипомещают нанесенный на силикагель 17.967 ЯР наэту колонку. Элюирование проводят последовательно с помощью следующих растворителей: хлороформ- метанол-ацетон (78 - 20 - 2 об.%) 4 л, ацетон4 л. Элюаты концентрируются до обьема 100 мл,Так как в ходе концентрирования 17,967 ЯР высаживается, добавляют 50 мл диметнлформамида,чтобы растворить зтот осадок и сконцечтрнроватьснова до 50 мл. Медленно добавляют и течение1 час 30 мл воды, чтобы вызвать кристаллизацию 17.967 ВР. Кристаллы фильтрувп, лромыва.ют 20 мл щтоксана и высупюивают и течение 15 часпри 50"С в вакууме (5 мм Нд). Получают 1,17 г очищенного 17,967 ЯР, имеющего активность 925 е 11/мг,Антибиотик 17,967 ЯР обладает антибактери. альной активностью по отношению к бактериям различных видов, Он не проявляет заметной пере. крестной резистенции с хромомицнном, руфохро. момицином и фуыорубицином и обнаруживает незначительную перекрестную резистенцию с актино. мицином,Антибиотик обладает также бактериостатичес. кой активностью по отношению к некоторым возбудителям инфекции. Кроме бактериостатической активности антибиотик обладает антиопухолевой активностью при введении его под кажу или внутрибрюшинно. Эту активность определяют на опухолях, привитых мышам, таких как, саркома 180 (твердая форма), асцидные клетки Эрлиха и лейке. мия 1. 1210, при дозах в пределах 0,2 - 0,005 мг/кг, При саркоме 180 у мышей подкожное введение дозы 0,05 мг/кг в день в течение 5 дней вызывает уменьшение веса опухолей по отношению к весу опухолей у контрольных животных на 80%.Токсичность антибиотика определяют на мышах при введении им дозы вещества подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или перорально в течение 5 дней подряд. ЛД,о, определенные для подкожного введения 15,000 мг/кг, внутрибрюшинного - 0,055 мг/кг, внутривенного - 0,150 - 0,175 мг/кг. Формула изобретения Способ получения антибиотика, о т л и ч а ющи й ся тем, что штамм Ятгертоеусев говеорЫ 1 атов 08 20.073 (й ЯЯ 1 3430) культивируют в азробных условиях на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известными приемами.