Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1797062 т) .ъьЫ й)5 0 01 Й 33/4 РЕТЕНИ ст со ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) 2-й Московский государственный медицинский институт им, Н,И.Пирогова(54) СПОСОБДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНЫХЗАБОЛЕВАНИЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ Изобретение относится к медицине и применяется для определения патологических изменений со стороны соединительной ткани при различных системных заболеваниях,Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани путем исследования сыворотки крови заключается в том, что для повышения точности и сокращения времени исследования в сыворотке крови и в моче определяют содержание гликозаминогликанов (ГАГ).Для диагностики системных заболеваний соединительной ткани исследуются различные параметры, в частности исследуется соотношение между белковыми фракциями, для чего применяется электрофоретическое разделение на бумаге, Принцип определения основан на различной скорости перемещения фракций в электрическом поле. Для системных заболеваний характерна гипергаммаглобулинемия, наиболее выраженная в активной стадии, при тяжелом течении патологического процесса, В то же время диспротеинемия может отсутствовать у 40-70(57) Применение; медицина. Сущность изобретения; определяют соотношение между содержанием гликозаминогликанов в сыворотке крови и в моче. Системное заболевание соединительной ткани диагностируют при значении этого соотношения 0,07 и выше. Цель изобретения - повышение точнои диагностики нарушений метаболизма единительной ткани. больных, Данный признак рассматриваетсякак неспецифический,В диагностике также используется опре- Бделение содержания С-реактивного белкаунифицированным методом кольцпреципитации в капиллярах, Принцип метода основанна том, что сыворотка крови, содержащая белок острой фазы, образует хлопьевидн ый преципит при взаимодействии соспецифической преципитирующей иммун- Оной сывороткой к этому антигену. При низ- ОЬкой активности процесса, нетяжелом Ятечении С-реактивный белок может отсутст.левать. Покааатель не выявляется у бб.ббоьбольнык,также является неспецифическим,Отсутствие корреляции между указан ввввввцми показателями и точностью диагностики ограничивает их значимость,Известен способ диагностики системных заболеваний путем исследования ГАГ всыворотке крови.Метод состоит из этапов; 1) ферментативный протеолиэ сыворотки крови, осуществляемцй добавлением к 1,5 мл свежейсыворотки 0,3 мл раствора проназы с последующим инкубированием в течении 4 ч при45 С; 2) депротеинизация полученного гид. ролизата с последующим выделением иочисткой полученных ГАГ; 3) определениеГАГ по уроновым кислотам карбазоловцмметодом,Данная. работа принята за прототип, Посравнению с предлагаемой она менее точна,Цель изобретения - повышение точности и ускорения способа диагностики нару.шений метаболизма соединительной ткани.Поставленная цель достигается тем, что определяют ГАГ в сыворотке крови и в моче,причем исследование ГАГ в моче проводятпосле ее фильтрования и инкубации 2-2,5 млс цетилпиридинийхлоридом в течении 25-35минут, определяют соотношение между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в мочеи путем увеличения данного коэффициентадиагностируют системное заболевание соединительной ткани,Новым в представленном способе является определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче.Дополнительно разработан тест по выявлению степени тяжести патологического процесса, активности системных заболеванийсоединительной ткани, В определении содержания ГАГ, зкскретируемых с мочой, после фильтрации исследуемого материала и. инкубирования с цетилпиридинийхлоридом, производится измерение на ФЭКеСущность изобретения поясняется следующим образом,П р и м е р, Больной Ю., 16 лет, поступилс диагнозом: генерализованная бляшечнаясклеродермия, с жалобами на неприятныеощущения типа легкого жжения, покалывания в области пораженного участка кожи нанаружной поверхности правого бедра, стянутость в области голеней, Считает себябольным около 2 месяцев, когда после переохлаждения стали появляться сиреневатцепятна на коже груди, живота, бедер. Ранеелечение не проводилось,При поступлении общее состояние -удовлетворительное. Со стороны внутренних органов патологических изменений невыявлено, На коже шеи, груди, живота,предплечий, плеч, голеней имеются распространенные, сливающиеся очаги поражения, сиреневато-Фиолетового цвета,уплотненные, с частично атрофированнойповерхностью, занимающие большую частькожного покрова, 8 области наружной поверхности правого бедра имеется белесовато-желтый уплотненнцй очаг до 6 см вдиаметре, окруженный розовато-сиреневым венчиком до 0,3 см шириной, постепенно переходящей в неизмененную кожу, У больного взяли 4 мл крови из локтевой вены, 2,5 мл мочи для определения содержания ГАГ.Кровь оставляли для коагуляции на 45 5 мин при 4 С, затем центрифугировали при500 д 45 мин при 4 С. Добавляли 0,2 мл раствора проназц, содержащей 15 мл проназы Е ( на 1 мл 0,05 М трисацетатного буфера при рН 8). После протеолиза в тече ние 4 ч при 45 С добавляли 2,4 мл водяногораствора 17"-,ь йаО, а затем 60 мл 3 й уксусной кислоты; заткнули пробиркоу пробкой и нагревали, выдерживая при 100 С в течение 5 мин и охлаждали в водяной бане, Центри фугировали при 30 000 д в течение 20 мин,затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещал в стеклянную пробирку, Добавляли 9 мл этанол/ацетата при 4 С (0,2 г ацетата к 250 мл этанола), встряхивали, 20 выдерживали 1 ч при 4 С и центрифугировали при 3000 о 20 мин при,4 С. Декантировали супернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтрованной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,015 о це тилпиридинийхлорида при 37 С в 0,02 МйаО. Смешивали энергично до полного ресуспендирования осадка и. оставляли на 15 ч при 4 С. Нагревали пробирку до 20 С и .центрифугировали при 3000 о 20 мин при 30 комнатной температуре. Осторожно удаляли супернатант и оставляли пробирку перевернутой на Фильтровальной бумаге в течение 5 мин, Добавляли к осадку 0,25 мл 0,15 й серной кислоты и переносили в 37 С.35 Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М йа тетрабората в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4 С и вливали медленно по стенке пробирки. Смешивали, пробирку помещали в ледяную ба ню, затем накрывали и нагревали 5 мин при100 С, Охлаждали до комнатной температуре, перемешивали и переносили в спектрофотометрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм. Вычисление произ водили по Формуле:А твкс оновые кислоты сыво отки12А стандартА гексуроновые кислоты сыворотки - абсорбция сыворотки50 А стандарт - абсорбция стандарта1,22 - фактор корреляции, соответствующий потере объема 1 мл сыворотки в процессе тестастандарт: 10 мг глюкуроновой кислоты в 55 0,25 мл 0,15 й серной кислотыА гвкс оновыв кислоты сыво откиА стандарт1,083 1,220,55=24 мг гАгоо мл сыворотки ==2,410 лДля определения экскретируемых ГАГ вкачестве контрольной пробы взяли 1 мли рофильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитратного буфера, в качестве опытной пробы - 1мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпиридинийхлорида; одновременно сопытнойи контрольной пробами ставился стандарт:в пробирке вмешивали 0,1 мл основногостандарта, приготовленного из расчета 0,02г хондроитинсульфата на 100 мл 0,1 М цитратного буфера, 0,9 мл Н 20, 1 мл 0,1-ногоцетилпиридинийхлорида. Во всех пробирках содержимое. перемешивали, после 25мин пребывания при комнатной температу ре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКепротив Н 20 в кюветах0,5 см, синий светофильтр М 3. СодержаниеГАГ определялось иэ расчета на количествокреатинина, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы взяли0,5 мл свежей профильтрованной мочи, 3 мл2 -ного раствора пикриновой кислоты,тщательно перемешзлй и добавили 0,2 мл10 О-ной йаОН, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н 20 да объема100,мл; в качестве контрольной пробы; к 3мл 2 ф 2-ного раствора пикриновой кислотыдобавяли 0,2 мл 10% ИаОН и довели до 100мл Н 20; в качестве стандартной пробы: 3 мл2%-ной пикриновой кислоты, 0,2 мл 10 о 22йаОН добавили к 0,5 мл основного растворастандарта креатинина, после 10 мин прикомнатной температуре добавили Н 20 до100 мл; измерили против контроля опытнуюи стандартную пробы на ФЗКе 56 с синимсветофильтром Ь 3. Получили содержаниекреатинина,. рассчитанное по формуле100= ВО мг%,гдеЕ стЕ ов, - экстинкция опытной пробыЕ ст. - экстинкция стандартной пробыСодержание ГАГ рассчитывали по формуле:Е ст,к.х.= Е а 20 -е - -2 - г гдггтгхреат.Ест.Еок,0100 20 030 012 0180= 30 г ГАГ/кг креат где Е о, - экстинкция опытной пробыЕ ст.к. - экстинкция Стандартной пробыдля креатининаЕ ст. - экстинкция стандартной пробы ГАГЕ о.к. - экстинкция опытной пробы кре- атинина20 - коэффициент корреляции, соответствующий потере объема.Так как показатели содержания ГАГ в сыворотке крови и в моче могут колебаться в сравнительно больших пределах, но в организме постоянно поддерживается баланс между синтезируемыми и экскретируемыми ГАГ, произвели определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче, используя для удобства умножение коэффициента на 10 . У больного Ю. коэффициент составил:102ГАГсыво отки к овиГАГ мочи 5 10: 10 2г ГАГ/кг креат, = 0,08 .2 241030 Для сравнения у здоровых доноров ко 20 эффициент составляет в среднем0,04 + 0,009г гГАГл кг креат,П р и м е р. Больная К., 16 лет, поступилас диагнозом: системная склеродермия, с жа 25 лобами на общую слабость, недомогание,неприятные ощущения типа легкого жжения, "бегания мурашек" по коже, уплотнения кожи кистей, предплечий, изъязвленияна коже кистей, ограничение подвижностимелких суставов кисти, локтевых, коленных,потерю массы тела, Ранее лечение не проводилось,При поступлении общее состояние - от носительно удовлетворительное. Больная пониженного питания, отмечается анемия лица,сужение ротовой щели, диффузное уплотне.ние кожи, более выраженное на кистях, предплечьях, диффузная гиперпигментация,выражены сгибательные контрактуры в мел 0 ких суставах кисти, объем движений в локтевых и коленных суставах ограничен. В легкихдыхание - везикулярное, тоны сердца - приглушены; ритмичны, живот - мягкий, безболезненный, печень. не увеличена, симптомПастернацкого - отрица.тельный с обеихсторон, У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 3 мл мочи для определения содержания ГАГ.Кровь оставляли для коагуляции на 4550 минпри 4 С,азатемцоентрифугировалипри500 9 45 мин при 4 С. Добавили 0,2 млраствора. проназы, содержащей 15 мл проназы Е (на 1 мл 0,05 М трисацетатного буфера при рН 8), После протеолиза в течение 4ч при 45 С добавляли 2,4 мл водного раствора 17-ной НаС 1, а затем 60 мл 3 Йуксусной кислоты, заткнули пробирку пробкой и нагревали, выдерживая при 100 С втечение 5 мин и охлаждали в водяной бане.Центрифугировали при 30000 д втечение 20 мин, затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещали в стеклянную пробирку, Добавляли 9 мл зтанол/ацетата при 4 С (0,2 г ацетата к 250 мл этанола), встряхивали, вы держивали 1 ч при 4 С и центрифугировали при 3000 д 20 мин при 4 С. Декантировали супернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,0147 ь цетилпиридиний" 10 хлорида при 370 С в 0,02 М МЭС, Смешивали энергично до полного ресуспенирования осадка и оставляли на 15 мин при 4 С. Нагревали пробирку до 20 С и центрифугировали при 30009 20 мин при комнатной температуре. Ос торожно удаляли супернатанти оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин. Добавляли к осадку 0,25 мл 0,15 М серной кислоты и переносили в 370 С. Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М тетра бората в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4 С и вливали медленно по стенке пробирки. Смешивали, пробирку помещали в ледяную баню, затем накрывали и нагревали 5 мин при 25 100 С, Охлаждали до комнатной температуры, перемешивали и переносили в спектрофотометрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм, Вычисление производили по формуле: 30 А гекс оновые кислоты сыво отке х 1,22 А стандартСтандарт.10 мг глюкуроновой кислоты в 0,25 мл А стандарт- 360 1060,55Для определения экскретируемых ГАГ в качестве контрольной пробы взяли 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитратного буфера, в каЧестве опытной пробы - 1,мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпиридинийхлорида; одновременно с опытной и контрольной пробами ставился стандарт:в пробирке смешивали 0,1 мл основного стандарта, приготовленного иэ расчета 0,02 г хондроитинсульфата на 100 мл 0,1 М цитратного буФера, 0,9 мл Н 2 О, 1 мл 0,1 мл цетил 50 пиридиниЙхлорида. ВО всех пробирках содержимое перемешивали, после 35 мин пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКе 56 против Н 2 О в кюветах 0,5 см; синий светофильтр М 3. Содержание ГАГ определялось из расчета на количество креатинина, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы взяли 0,15 Й серной кислоты 35А гекс оновые кислоты сыво тки х 1,22 0,5 мл свежей профильтрованной мочи, 3 мл 2-ного раствора пикриновой кислоты, тщательно перемешали и добавили 0,2 мл 10-ной йаОН, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н 20 до объема 100 мл; в качестве контрольной пробы; к 3 мл 2 оД раствора пикриновой кислоты 0,2 мл 10-ной ИаОН и довели до 100 мл Н 20; в качестве стандартной пробы: 3 мл 2 пикриновой кислоты, 0,2 мл 10 йзОН добавили к 0,5 мл основного раствора стандарта креатинина, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н 20 до 100 мл; измерили против контроля опытную и стандартную пробы на ФЗКесиним светофильтром Ь 3. Получили содержание креатинина, рассчитанное по формуле:Е оп 100.- 90 мг%, гдегде Е оп. - экстинкция опытной пробыЕ ст. - Экстинкция стандартной пробы Содержание ГАГ рассчитали по формуле:Е оп20 Е ст.к.оп ст.к. ГАГЕ ст .Е ок0,24020 0,300,12 0,270 - 44 г ГАГ/кг креат. где Е о, - экстинкция опытной пробыЕ ст,к. - Экстинкция стандартной пробы для креатининаЕ о к - экстинкЦИЯ Опытной пРобы кРеатинина20 - коэфФициент корреляции, Соотношение между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче составило:3,60 10 г г ГАГ44л кг креат.г гГАГл кг креат,П р и м е р. Больная С 66 лет поступила с диагнозом: склероатрофический лихен, сопутствующее заболевание: сахарный диабет легкой степени тяжести, Предъявляла жалобы на легкий зуд, периодически - чувство покалывания, жжение на различных участках кожного покрова, высыпачия на туловище, конечностях.При поступлении общее состояние - удовлетворительное. Больная повышенного питания, имеется диффузное поражение кожного покрова в виде белесоватых участков атрофии, с блестящей поверхностью, частично сливающихся, Со стороны внутренних органов на момент осмотра патологических изменений нет. У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 3,5 мл мочи для определения содержания ГАГ.Кровь оставляли для коагуляции на 45 мин при 4 С, а затем центрифугировали при 500 9 45 мин при 4 С. Добавили 0,2 мл раствора проназы, содержащей 15 мл пронаэы Е (1 мл 0,05 М трисацетэтного буфера при рН 8), После протеолиза в течение 4 ч при 45 С добавляли 2,4 мл водного раствора 17-ной йаС 1, а затем 60 мл 3 й уксусной кислоты, заткнули пробирку пробкой и нагревали, выдерживая при 100 С в течение 5 мин и охлаждали в водяной бане. Центрифугировали при 30 000 9 в течение 20 мин, затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещали в стеклянную пробирку. Добавляли 9 мл этанол-ацетата при 4 С 0,2 гацетата Иа к 250 мл этанола), встряхивали, выдерживали 1 ч при 4 С и центрифугировали при 3000 9 20 мин при 4 С. Декантировэли супернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,015 цетилпиридинийхлорида при 37 С в 0,02 М йаО. Смешивали энергично до полного ресуспенирования осадка и оставляли на 15 ч при 4 С Нагревали пробирку до 20 С и центрифугировали при 3000 9 20 мин при комнатной температуре. Осторожно удаляли супернатант и оставляли пробирку пе ревернутой нэ фильтровальной бумаге в течение 5 мин, Добавляли к осадку 0,25 мл 0,15 й серной кислоты и переносили в 37 С. Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М тетрабората йа в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4 С и вливали медленно по стенке пробирки, Смешивали, пробирку помещали в ледяную баню, затем накрывали и нагревали 5 мин при 100 С. Охлаждали до комнатной температуры, перемешивали и переносили в спектрофотометрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм, Вычисление производили по формуле:А гекс оновые кислоты сыво отки х 1 22А стандарт1,062 1,22 2 3610г/л0,55Для определения экскретируемых ГАГ в качестве контрольной пробы взяли 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитратного буфера, в качестве опытной пробы - 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпиридинийхлоридэ; одновременно с опытной и контролькой пробами ставился стандарт; в пробирке смешивали 0,1 мл основного стандарта, приготовленного из расчета 0,02 хондроитинсульфатэ нэ 100 мл 0,1 М цитратного буфера, 0,9 мл Н 20 1 мл 0,1 М цетилпиридинийхлорида. Во всех пробирках0 07 г Ал кг креат.Представленные примеры демонстрируют увеличение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в мочедо 0,07 и выше. Определение данного пара 40 метра позволяет повысить диагностическуюточность до 81 по сравнению с 63 прииспользовании прототипа. В 197 С, случаевувеличения параметра до 0,07 и выше отмечено не было.П ри ме р. Больная Б 20 лет, поступилас диагнозом; бляшечная склеродермия; сжалобами нэ неприятные ощущения типалегкого жжения, покалывания в области пораженного участка кожи на наружной поверхности правого бедра. Считает себябольной около 5 месяцев, когда на местесильного удара появилась сиреневая полосадо 2 см в.диаметре, постепенно увеличивавшаяся, Ранее лечение не проводилось,При поступлении общее состояние -удовлетворительное,Со стороны внутренних органов патологических изменений не выявлено, Нэ наружной поверхности верхней трети правого.бедра имеется белесоватый очаг размером содержимое перемешивали, после 30 минут пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКепротив Н 20 в кюветах 0,5 5 см, синий светофильтр М 3. СодержаниеГАГ определялось из расчета на количество креатинина, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы: 3 мл 2-ный пикриновой кислоты, 0,2 мл 107 ь 10 МаОН добавили к 0,5 мл основного растворастандарта креатинина, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н 20 до 100 мл; измерили против контроля опытную и стандартную пробы на ФЭКес синим 15 фильтром М 3. Получили содержание креатинина, рассчитанное по формулеЕ оп, 100 - 75 м %Е ст.Содержание ГАГ рассчитали по форму ле;1797062 12 А гекс оновые кислоты сыво отки А стандарт- 2,34 мг ГАГ/100 мл0,55 х ок. ст Г ГАГ/кг креат, =Еок. 20ЕстЕст.кЕ оп.Ф0,150200,30 ГАГ/0,12 0,180 Ффильтрования и инкубации 2-2,5 мл мочи с цетилпиридинийхлоридом а течение 25-35 мин, затем рассчитывают соотношение между содержанием гликозаминогликанами в сыворотке крови и в моче и при значении полученного показателя 0,07 и выше диагностируют системное заболевание соединительной ткани. Составитель Ю.КнязевТехред М.Моргентал Корректор Н.Ревская Редактор Заказ 651 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 до 4 см, плотный, окруженный сиреневой , полосой до 0,3 см шириной, постепенно переходящей в неизмененяю кожу. У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 2,5 мл мочи для определения содержания ГАГ,Кровь оставляли для коагуляции на 45 мин при 4 С, а затем провели определение содержания ГАГ по приведенной выше методике. Вычисление проводили по формуле: сыворотки = 2,3410 г/л.Для определения экскретируемых ГАГ контрольную, опытную и стандартную пробу ставили в соответствии с описанием, приведенным а примере 1. Во всех пробирках содержимое перемешивали, после 35 мин пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЗКепротив Н 20 в кюветах 0,5 см, синий светофильтр Ь 3.Содержание ГАГ рассчитали по формуле,Формула изобретенияСпособ диагностики системных заболеваний соединительной ткани путем исследования сыворотки крови, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что с целью повышения точности способа, в сыворотке крови и в моче опре-, деляют содержание гликоэаминогликанов, причем определение в моче проводят после=45 г ГАГ/кг креат.где Е ст.к, - экстинкция стандартной пробы для креатининаЕ ол. к -экстинкция опытной пробы ГАГ 5 Е ст. - экстинкция стандартной пробыГАГЕ оп. к - экстинкция опытной пробы креатинина,20 - коэффициент корреляции, соответ ствующий потере обьемаТак как показатели содержания ГАГ всыворотке крови и в моче могут колебаться и сравнительно больших пределах, но а организме постоянно поддерживается баланс 15 между синтезируемыми и экскретируемымиГАГ, произвели определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче, используя для удобства умножение коэффициента на 10 . У больной Б. коэффи циент составил:ГАГсыао Отки к ови 102очи 2,3410225 -45 г ГАГ/кг креат. 10 =0,052. Для сравнения у здоровых доноров коэффициент составляет в среднем 30 0,04+ 0,009. В данном случае егог,г ГАГкг кр.повышение не позволяет диагностировать системное заболевание соединительной ткани, так как показатель не достигает 0,07.