Способ получения солей n-ацил-или n-арилдезоксинуклеозид-5 -фосфатов

(51)5 С 07 Н 19/10, С 07 О 239/47, 473/18, 473/34// А 61 К 31/70 МИРЗУЪ.И 1 ло 1:;: 11 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН У СВИДЕТЕЛЬСТВУ ВТ Р где ннсос 14 нсос 5 н 5В- БнбЯ1 бН 14 н оВ= оннн о1, ин 14 нссн(сн,1,Выход: 1 а, 80,2 ; 16, 8470; 1 в, 78 "/О, Реагент1; триметилхлорсилан. Реагент 2; дезоксинуклеозид, Условия реакции; в среде пиридина, 4 - 5-кратный избыток реагента 1,Реагент 3: ацил- или арилхлорангидрид соответствующей кислоты, Условия реакции: всреде пиридина при малярном соотношении реагент 3; реагент 2 =(2 - 3):1 с выдерживанием реакционной смеси при комнатнойтемпературе и охлаждением до 0+30) С,Реагент 4: 1,5 - 2,5 н водный раствор аммиака, Условия реакции; в присутствии триэтиламина, взятого в эквимолярном количествек суммарному количеству реагентов 1 - 3 селением целевого продукта обращенноовой хроматографией,З з.п, ф-лы,9 табл,(72) И,В.Цверова и В,П.(56) В.К.РаБос., 1961,й, Н,И,Ко ков, Е,И.Дужи аростинЬ, Н.О,КЬогап 83, ГФ 13, рр1. Агп. С 26 в 29,ЧЕНИЯ СОЛЕЙ ЛДЕЗОКСИ НУКЛ Ев качестве промежусинтезе биологичетв и для получения в медицинской диагизобретения; прой-ацил- или еозид-фосфатовВн ов(с 1 н 51514 нон выд фаз ороообретение о менно к усо получения -деэоксинук рмулы 1 Изров, асобуЙ-арилщей ф носится к хими ршенствованно солей М-ацилеозид-фосфато и сах му сп которые могут быть использован ве промежуточных продуктов в с зоксиолигонуклеотидов, яв биологически активными вещест же для получения ДНК-зондов дл ской диагностики,Известен способ получения И-арилдезоксинуклеозид-фос тем взаимодействия избытка арилхлорангидрида с дезоксину фосфатом в пиридине с последу лочным гидролизом образован или арилфосфатных и 3 -0-ацилфирной связей, Для этого реа смесь после ацилирования при температуре обрабатывают 1 1 ч 1 МаОН при О С в течение 5 - 10 м дующей нейтрализацией избыт ы в качестиьтезе деля 1 ощихся вами, а такя медицино-р-осн, о(" н 1 сн,) ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Новосибирский институт биоорганиской химии СО АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУ АЦИЛ- ИЛИ И-АРИ 3 ИД-ФОСФАТОВ (57) Использование: точных продуктов в ски активных вещес ДНК- и РНК-зондов ностике. Сущность дукт: соли М-арилдезоксинчкл формулы 1; М-ацил- или фатов пуацил- или клРззид 1 ющим щень к ацилили арилэкционнуюкомнатной раствооом ин с послека щелочиНЕЛПС)Я 1010 ГЬ)СС):,Гд"продукт я (для ц, "с - 70 с- с 3,70;/,);- нобхо,)1 с 1,1 рсгь цс.ДобЛОК 1 ОС)Вс)ЦИ 11 В жЕСт,Ис)01, 0" С, 5- 16 ли ), рвода полуэе,1 о 11 на)ри 3-,дэ г) цир 3 лдс, н,;с),О сольСьнс,С) Н я с"; О ; щ сО С 1. 0 СЯ ПО 3 П:,ИЕ С)ЬХСЛЯ ЕГС Г .уг) рошеи и роцесся.ПОСТОЗЛЕ 1 С)я цЛЬ доя 1 13 с ГС 1 Г 3 С Л Л,ГЭЕМс М Способ)осс) ГОГу Е).)я Г,.,Н 3, ГИ Г,.арилдезокс 1 нуклес)зид- )рс,:3О 13.Вкл юч цгИм вз 41 Р ддйгт аарИЛХГОрс)гидИЭ СО 1 . ВЕ, С,ТГ)уЮЛОТЬ С СООГВЕТСТВУГОДИК Е)ОКО Ук;.ТС,-1дом в пиоидино Гги мгь)ю)1 сод 3 О 3.1и(2 - 3):1 с г)осгс)г)у)с 3,к 1,:ь 3,ес)жс 1 г;я 3;, )л ,.ИОН Н Ой СМЕСИ,". р 1 Ко;.1 Н;)т О и тс 1. :Е,. 131,",ОХЛЭ)К Св1;,1 З Той С;1 Си - С)ПО;3 1 ЗР): с,)с).ДУКта РЕсСКЯ 1,1 И И НДЕ)3. - ;ИС)М СЕЛВОС) Ц О.дукта Хргя Г; Г)ЭФ;1 й, П )и 31 ц,сДЕЗОКСИНУКЛЕО; ".:;,:,:,: С)РС 1111,1, ОГ)пс)Г;ЭтьВЭ 1 от 4- к 3,:с" 1 3 збь,гког 1 1;)ц),. 1 -ЛОРСИ)1 ЭНЭ Я3 С;:.,:, Я. 1)С ) Я 3 иГидрОЛИЗЭ СМсь О;я.,1,. я О дя ( 1,.),рОЛИЗ ОСусСЗЕСтг)Г.: )С)т 1с,5 1 ВС),31;Ь 1 ря -твором:)ммиякя 1,р)1 с.С)гитриэтиламиня, взя)сл о в коли )есВ зкс)с 1 МОЛЬ)ОМ ПО Отцсс)С)Е)ИК К С" М 1 с П Осиу КОГИчеству исходНх )еяге сЭв, вкл о ВяТРИМЕТИГХЛОРСИЛЭГ 1, Я С)ЯГ)цгой Г)РОДЧК). Г).1,гЕЛЯЮТ Об)рЭЩЕННО-".,;,ЭЗС)С)Ой срос):3 ГОГг)я 33.1 й Ввиде солей тризтилэм;)оция )рГ)ем в сучэеполучения аде озинСс)дс)ж)3 цс-;О продукт,"РЕЭКЦИОЫ,)ГЮ СМЕСЬ ВЬДСРж 31 ВЯЮт В 1 ЧЕ,1 с.90 - 120 мин, при погучвгп 1)1 с)1 ги)111 с дерлсащего продукта - 55 м)1 я в слуЭгуанозинсодеркащего 30-60 в.П р и м е р 1, Синтез М -г)ец:.о 3;гдез )кСИаДЕНОЗИН-СЬОСфс)ТЯ, т РИЗ Г);Я.,;1;ОНИйНОИ СОЛИВ кру Гл Одон ну ю кол бу в м с. с т 1)сс)ь с) 50мл загружают 1 г(3,02 ммог Ь) д. зс)асс де,Озин-11)ог 4)сэта в Н 2-фо 1 рме )1 су.;яг в ьссикаторс нэд Р 20 В при 4 мм рг, сг, В тссе";40 мин. х, Вь)суше)-ному нуклео) исОК 1 у .)с)- териалу добавляют 4,6 мг г)иридинэ л 153мл (12,08 ммоль) триметилхлорсилс 3)я, здкрьВают колбу и встряхивя)от ее в течение15 мин при комнатной темпег)ятурс 3 Э 1;ц и 313.р)гНо; .Эссе с обрязо С),1, Р,1 ц 31 р 1 д 11 сГОрцдб ЦОП Т 3 )1 п Гв Г)Л )ПЗОЛь) бЗОИЛ:пг 1;Э 1)О 1 те;.31,; Урс;, 1 олу с:"уо вод я Г 11 О)д 1 г ИЕ "у)О С:МЕСЬ усЭ ,13 с 3 ОТ 1 Э рОТЭ 1 цс 1 цсг 3 ягнц: ,".о Г 1 асгц. Гбгязногогэ 3 кэ зят 3 с 1, тот остятс; упяг)3 лс)яОг с то;,:1:.с 1 2 Х 20 МЛ 1 К ГОцуЧЕННОМу ОСтатКу дОя 3 . о 2 )Ил0 и япес)т .э колоку с,сл:то 1 Г,и 1 "ссрб ( с 1Г) О"),см соло 1 О 3;. Л 1 33 ОГ, - ,Т ЛК).1 К) СяЭся ВО,-,.тек,; ,:Иго)1 Э)СТО)1.1 ТРИЛЭ0 . - ,., 1 "ряки;о, содержа,К, с Ч- )О 3,О: УЦЯР,-)Ют И С)ЬСЭ)СИ;.:)с г: С г)и -.1 р БЬ ПЭ.333 ий ОСадОК) 3 Ф 1 л ьтпц вь ВяО , 13 г В г)якуумкги кяГПП)ХОс Г 1,ГС 3;:3 ГГ - 1,30 ГГЯ,2 "4), )ЛЕ с:цтц й яя л из; С 52.(51,49); Н 6,10 (6,20);г 1у (16 21,( сксс.б Эх гр)лведс)3 ь 1 творе," с :И - ,3 (;)3;:КтГ)ЭЛЬ 1 ЬИ яЭЛИЗ.с)я 1 ц" Г," гь60 0,85 + 0,03 7 0 / 2 б 010 8 0 / 2 6 0 Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют соотношения бензоилхлорида к дезоксинуклеотиду, Результаты приведены в табл, б, 55П р и м е р ы 40 - 43, Определение оптимального соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду. бутирилирования ведут 30 мин, ВыходТЭА брЬцб - 0.98 г(78). Элементный анализ: С 47,0 (46,33), Н 6,75 (6,80); М 16,23(16,21). Спектральный анализ;Е 2 бо=1,75 10 М см 5Спектральные соотношения в буфереТрис-ацетат, рН 8,0:250/220,7620,722 9 0 / 2 б 00,60П р и м е р ы 4-11, Выбор времени 15реакции бензоилирования для брА,Синтез ведут аналогично описанному впримере 1, при этом время выдерживанияреакционной смеси после добавления бензоил хлорида меняют от 5 мин до 3 ч. Результаты приведены в табл. 1,П р и м е р ы 12 - 15, Выбор времениреакции бензоилирования брС,Синтез ведут аналогично описанному впримере 2, при этом время реакции бензоилирования меняют от 2 мин до 60 мин,Результаты приведены в табл, 2,П р и м е р ы 16 - 20, Выбор времениреакции изобутилирования брб,Синтез ведут аналогично описанному в 30примере 3, при этом время реакции изобутилирования меняют от 2 мин до 60 мин.Результаты приведены в табл, 3,П р и м е р ы 21 - 27. Определение оптимальной температуры реакционной смеси 35при добавлении водного аммиака,Синтез ведут аналогично описанному впримере 1, при этом меняют температуруреакционной смеси перед гидролизом водным раствором аммиака от 37 до -30 С, Результаты приведены в табл, 4,П р и м е р ы 28 - 34. Выбор оптимальнойконцентрации водного аммиака в реакционной смеси,Синтез ведут аналогично описанному в 45примере 1, при этом меняют концентрациюаммиака в реакционной смеси от 0,5 до 4,0М. Результаты приведены в табл. 5.П р и м е р ы 35-39. Определение оптимального соотношения ацилхлорида к дезоксинуклеотиду. Синтез ведут аналогично описанному впримере 1, при этом меняют соотношениятриметилхлорсила на к дезоксинуклеотиду,Результаты приведены в табл, 7,П р и м е р ы 44 - 45. Обоснование необходимости использования в процессе триэтиламина,Синтез ведут аналогично описанному впримере 1, при этом перед гидролиэом реакционной смеси водным аммиаком водномслучае добавляют триэтиламин (пример 44),в другом случае (пример 45) - не добавляют.Результаты приведены в табл, 8,П р и м е р ы 46 - 47, Выбор методавыделения целевого продукта.Синтез ведут аналогично описанному впримере 1, при этом выделяют целевой продукт обращенно-фазовой хроматографией(пример 46) или хроматографией на целлюлозе (пример 47). Результаты приведены втабл, 9,Таким образом, предложенный способполучения солей К-ацил- или К-арилдезоксинуклеозид-фосфатов позволяет повыситьвыход целевого продукта с 49 - 70 до 78 -84 и упростить процесс за счет применениядля выделения продукта высокоскоростнойобращенно-фазовой хроматографии, исключения трудоемкой стадии хроматографического перевода натриевой солинуклеотидного материала в пиридиниевую(процесс длительный, требует упариваниябольших объемов водных растворов элюата,что можно отнести и к хроматографии на целлюлозе), а также за счет того, что стадия гидролиза не требует строгого технологическогоконтроля за временем и температурой процесса, Кроме того, предлагаемый способ позволяет снизить количество примесей вцелевом продукте до 3 - 5 .Формула изобретения1. Способ получения солей К-ацил- илиК-арилдезоксинуклеозид-фосфатов об 1щей формулыоМно-Р-ой о В +ОСН 5 ЗИНонгде В - остаток аденина - хнсос и6 5:т"в нили В - остаток цитозина нсос 5 н 5с,или.В - остаток гуанина -о он внсснсн,),,;: Г-,с., включая триметилхлорсилан, а целевой продукт выделяГО 1 обращенно-фазоВгй ХРОГИатоГРафивй В ВИДС СОУЕЙгризтиламГОния,5 2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я1 ЕГ 1, кГО ПРИ ПОЛУЧЕНИИ аДЕНОЗИНСОДЕРжа. го продукта реакционную смесь выдер; о .,ЛГ(от Р гетение ОО - 120 мин,3, Способ поп, 1, отличающийся1. Ге, что гГри получении цитидинсодержащео поодукта реакционную смесь выдержива;от в течение 5-15 мин,4, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что при получении гуанозинсодержа 5 Гцего продукта реакционную смесь выдергки ел ют в течен ие 30 - 60 ми н,Таблица 1 Г 5 тГИ 5 ГГГ,Е ВРСГоГРГГГ 1 РгдаКГГГИ боЗОРО: - .,ЛГ.ГЯ ИДОЛО ПРЕВРЛЩЕНИЯ В ЦЕ/ГЕВ 01 ПРОДУКТ ГуРЕГоГ 5 ОРРГГ",Г МИЦ к"Доля 1 римери20 т 1Доля ;реГ 11:аьГГРГГГ , в целеьой продукт огГрод;, слГан ,1 азовай хрома го рлфии е 1 одом ГГКГкроколоно Гной Обращег Таблицапоевращения в целевой продукт ГГию к суГГ 4 5 ГГрГГО" Г:,о.и:Геству исхОд ых рс 13 ЛИяНИЕ ВрвкоЕГ-ГГ рЕЛКцИИ аС;ИЗОИЛИрОВЛГГИя Г ГГ,ОЛ ВРРкг;Я РЕСКЦИИ, МИН Пример Доля пре войращения в целпродукт, о 260 12 13 14 83 95, 96 95,блица 3 ВлиЯГГие вРемени РеРкЦии изобУТИРилиРоггзГГГЯ ГЯ Долю пРевРЛЩениЯ в Целевой пРОДУк Пример РГуеГИ 5 реакции, мин оля превращения в вой г Од кт, о 16 1718 19 20 60,0 75,2 87,5 93,3 94,0 2 г 5 0 6"з " ц 11"ЧГкгтЛГг - отвГ,ГС- Пу ПГ,Г д"си уклеотГГдом в ПИРГДДИЕт Г ГЧ; ГРР Я Гтк ГО;:, СС 1 ГГТ Гтт ОЕ ГГД 5в 5тгтг дР",:игл Г,токч кг пГгт; гк Гткги гГр К 0 ГктЛ Т Г Г.т ИР ГЕ р Л Т у .у Е С И С С ГС д уу ГСЛ цГИ ИОГ,ЗгтГ" ПР оДУКта ОЕЛКЦИ,ГИДЕЛЕГГГГт;с;м ГГ,: ГГсво Г 1 гГРД,:гтз АГРОт 1 ГГРГГ, о тт илг Г,Г г д р Р;1 1 к к г ;; т 1то П ГУ В ЫЛ СИ Я Г 1 Ы Х ОД а И Е кЕ Гт "; 11 ,гои Св г5 к 5 и Р)1 Е С г а, Д г; З О к С и кГ; ки; 1,Р е г 1- В Л рТ г Г ЬО О Г) 1 а б аГ; г. а ГО. Г;-;. П Л Г 11 Ь М избытко 1 грГтГие гилхлорсиГГЛл в срс,ГГГ", Г и ГИГ 1 ит 1 л, ГРреггт;ДГкРиИДГ 1 олиз, гГ;ег " -вллткдлГот до О С гидролиз осуГцествл Яс 1 1,5- 2,5 М Гчт: лньГ.к гулстсг 1 эг 5 м Л: ИЛКЛ Р ПРИСкГТСТВДИ ТГоЯ"ИГЛГ,:РЛ Доог,ВП Л и т Р Г" Р Р о К т;к О Л .Г кГ; г 1 гк гту1кк . превращения вцелевой продукт, в % 35,2 47,7 66,0 72,3 83,3 90,0 95,1 95,01768610Таблица 4 Влияние температуры реакционной смеси на долю превращения в целевой продуктТаблица 5 Влияние концентрации аммиака на долю превращения в целевой продуктТаблицаб Выбор соотношения ацилхлорида к дезоксинуклеотидуаблицыбор соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду1768")10 12 ТаблицаБ Влияние триатиламина на гь ход целевого продукта уг лов 1 я 1 ро.,Осла ход елевого прод 1 еред гидролизом добавля ю г э р и з 1 5 л а л 1 и Воз доба Бле ия тр 1 з 1 ипл:гна/4,б лица ияние ллетода выделения на выход целевого продукт кая Бне 1 вний вид це го продуктаО Составитель Б,СтаростинРедактор Техред М,Аоргентал Коррект лла ПОДПИСНОЕзобретениям и открыл иям при ГКНТ СССР Рауцская наб 4/5 льский комбинат Патент, г, Укгород. ул,Гагарина, 101 з твенно-изд ыход целевого про дукта, ",00, 1Заказ 3620 ТиражВНИИПИ Государственного комитета по113035, Москва, ЖБЕСЦ Е 5 НЫИ ГИГрошокГигр, порошо оттенком кремо цвега (г 1 римесиделя ются)