Способ получения l-2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил) масляной кислоты

ИЗОБ И Т аявка Японии Ь. быть использована в ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относится к биотехнологиии касается способа получения 1-2-амино(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной активностью,которая может быть использована в качестве гербицида. Цель изобретения - ускорение процесса. Проводяттрансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутстИзобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 1:2-амино-(гидро ксиметил фосфин ил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной актив 1731067 АЗ вии ИН 2-донора (глутаминовой или аспарагиновой кислот, или их смеси) и трансаминазы (глутаминовая кислота щавелевоуксусная кислота трансаминазы, или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси) или штаммов-продуцентов указанн ы х трансаминаз: Ятгертогпусез Ьуцгозсор 1 сцз ЯЕ(ЕЕВМ ВР, АТСС 21705) или Ятгертогпусез Ьудгозсор 1 сцз чР (ЕЕВМ ВР), или Ятгертопзусез 11 ч 1 с 1 апз бб (ЕЕКМ ВР), или Ятгертогпусез а ЬцзЕО 13014 (АТСС 3004), или Ятгертогпусез 9 г 1 зецз 1 ЕО 12875 (АТСС 23345), или Ятгер 1 оч 1 г 1 с 11 цгп сппагпопеца ЕО 12852 (АТСС 11874), или Ятгертогпусез ,ф аогооКаепз 1 з 1 ЕО 13416 (АТСС 19166), или йосагд 1 а гпес 1 Теггапе 1 АТСС 21271, или Я 1 чосагйорз 1 з баззопч 1 Ие СМ 3237, или (" Ятгертоаусез ч 1 ГЫосЬгогпоцепез 1 ЕО 13347 (АТСС 14925), или Ятгертоаусез чгоосЬгоподепез 1 СМ 4977, или М 1 сгоеопозрога сагЬопасеае ЙЯЙ 2972 (АТСС 27114), или Езсйег 1 сЫа со АТСС 10798, или Рзецс 1 огпопаз аегц 91 поза АТСС 10145, или Рзецбоаопаз серас 1 а АТСС бд 17759, или Яеггат 1 а Гпагсезсепз АТСС 13880, ф или Сапс 11 ба аЬ 1 сапз 1 АМ 4829, или Мцсог С зр 1 пезсепз 1 АМ М и 3 при рН 8-9, темпера- ( туре 28-50 С и молярном соотношении 4- ъ(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и ИН 2-донора 1:1-1;10, 6 табл,остью, которая можетачестве гербицида.Известен способ получения 1:2-амино-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кисоты формулыОлСНз Р - Сн - СН - СБ - СООИОН МНвключающий культивирование штаммапродуцента указанной кислоты с последующим выделением целевого продукта из кул ьтурал ьной жидкости.Недостатком указанного способа является большая длительность процесса, что затрудняет организацию промышленного производства продукта,Цель изобретения - ускорение процес,са,Поставленная цель достигается тем, что проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии глутаминовой или аспарагиновой кислоты или их смеси в качестве ИН 2- донора и в присутствии глутаминовая кислота - щавелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминаэы, или их смеси, или штаммов-продуцентов, указанных трансаминаз; Ятгер 1 огпусез у чозсорсцз ЯГ(ГЕРМ БР, АТСС 21705); Я 1 гертогпусез 1 у 9 гозсоо 1 сцз ИР(ГЕгсМ ВР); Ясгерюпусез 11 ч 1 с 1 апз 66 (РЕАЛ ВР); Я 1 герсовусез аЬцз 1 РО 13014 (АТСС 3004); Ятгертоаусез цгзецзРО 12875 (АТСС 23345), Ятгерочег 1 с 1111 цгп с 1 ппапопецгп 1 РО 12852 (АТСС 11874), Я 1 герюгпусез гпогоосаепз 1 з 1 РО 1341 6 (АТСС 19166), КосагФа гпес 1 теггапе 1 АТСС 21271; Косагс 11 орзз саззопч 1 е 1 1 СМ 3237; Я 1 гер 1 огпусез чг 1 с 1 осгоаоцепез РО 13347 (АТС С 14925); Я 1 гер 1 огпусез чгс 1 осЬгогпо 9 епез 1 СМ 4977; Мсгопюпозрога сагЬопасеае ИВЕ 2972 (АТСС 27114); ЕзсйегсЫа со АТСС 10798; Рзецс 1 оглопаз аегц 9 поза АТСС 10145; Рзецс 1 огпопаз серас 1 а АТСС 17759; Яегга 1 а пагсезсепз АТСС 13880; Сапс 11 с 1 а аЫсапз 1 АМ 4888 или Мцсог зрпезсепз 1 АМ Ми 3 при рН 8,0-9,0, температуре 28-50"С и малярном отношении 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и МН 2"донора 1:1 10.Способ получения аминокислот трансаминированием соответствующих оксокислот в присутствии глутаминовой или аспарагиновой кислот в качестве НН 2-донора и ферментов-трансаминаз известен, однако для получения 1-2-амина-(гидроксиметилфосфин ил)-масляной кислоты он используется впервые.Способ согласно изобретению осуществляют следующим образом.4-(Гидроксиметилфос фин ил)-2-оксомасляную кислоту обрабатывают по меньшей мере одной трансаминаэой в присутствиипо меньшей мере одного ЙНг-донора, например 1:глутаминовой или 1:аспарагиновой кислот или их смеси, в водной среде, в5 которой растворены 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляная кислота, ЙНг-донор .и трансаминаза. Процесс ведут при рН 8,09,0 и температуре 28 - 50 С. Способ такжеможно использовать, обрабатывая 4-(гидро 10 ксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту не самой трансаминаэой, а штаммоммикроорганизма, способным продуцировать по меньшей мере одну трансаминазу,При этом 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту и ИНз-донор вводят в15 питательный бульон микроорганизма, способного продуцировать трансаминазу, в котором суспендированы не подвергнутыехимическому воздействию клетки штаммамикроорганизма.Способ мокно осуществлять, обрабаты 20 вая 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту экстрактом микроорганизма,способного продуцировать трансаминазу,содержащим эту трансаминазу, в присутствии ИН 2-донора, Независимо от того, каким25 образом осуществляют способ, 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислотурастворяют с начальной концентрацией еев водной реакционной среде 0,1-100 мгмл.Молярное соотношение 4-(гидроксиметил 30 фосфинил)-2-оксомасляной кислоты и МН 2- донора составляет от 1:1 - 10 в однойреакционной среде,При протекании реакции между 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксогласляной кис 35 лотой, ЛЯНЬ-донором итрансаминазой или клеткамипродуцирующего трансаминазу штаммамикроорганизма согласно изобретениюполучается водный реакционный раствор,содержащий 1:2-амино-(оксиметилфосфи 40 нил)-масляную кислоту, непрореагировавшую4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту, используемую трансаминаэуили клетки используемого микроорганизма.Перед выделением целевого продукта из ре 45 акционной смеси осуществляют центрифугирование для отделения клетокиспользуемого микроорганизма.Выделение и очистку целевого продуктаосуществляют пропусканием реакционной50 смеси через колонку с катионообменнойсмолой, такой как Дауэкс 50 чч, которой абсорбируется целевой продукт, после чегоосуществляют его элюирование водой илиразбавленным водным раствором аммиака.55 В результате получают фракции элюата, содержащие 1:2-амино-(гидроксиметилфосфинил)-масляную кислоту. Фракции55 злюента собирают и концентрируют при пониженном давлении,П р и м е р 1, 4-(Гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту растворяют в 50 Ммоль фосфатного буферного раствора (рН 6), содержащего глутаминовую кислоту - щавелевоуксусную кислоту трансаминазы, :аспарагиновую и Е-глутаминовую кислоты, служащие в качестве ЙН 2-доноров,Процесс ведут при 50 С в течение 50 мин. Затем реакционную смесь нагревают при 100 С в течение 3 мин для завершения реакции, Величину рН реакционной смеси доводят до 2 добавлением разбавленного водного раствора серной кислоты и осуществляют центрифугирование для получения поверхностного раствора, Количество целевого продукта в поверхностном растворе определяют аминокислотным анализатором,П р и м е р 2, Штаммы, указанные в табл.1, подвергают индивидуально инокулированию в 40-миллилитровых порциях среды разведения, включающей питательный бульон, после чего осуществляют культивирование при 28 С в течение 6 ч. Полученные питательные бульоны, используют для инокулирования с инокулумом 2 О в 40-миллилитровых порциях питательной среды того же состава и кулитивирования в течение ночи при 28 С. В каждый из полученных питательных бульонов, содержащих клетки, вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомэсляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл,В каждый иэ полученных бульонов вводят натриевую соль -эспарагиновой кислоты в качестве МН 2-донора до концентрации 100 мкг/мл. После этого осуществляют ферментную конверсию, протекающую при 28 С в течение 24 ч, Величину рН полученной смеси доводят до 2 посредством 25 ф- ной серной кислоты для прекращения реакции. Клетки удаляют путем центрифугирования. Количество образующейся-2- амино-(гидро кси метил фосфин ил)-масляной кислоты, присутствующей в поверхностном растворе, определяют с помощью аминокислотного анализатора.Результаты суммирования в табл, 1, П р и м е р 3. Штамм Зтгертовусез Ьудгозсор 1 соз ЯЕ(ЕЕЯМ ВР) инокулируют в 10 мл предварительной среды разведения (включающей 2,0;ь растворимого крахмала, 1,0) полипептона, О,ЗО/ мясного экстракта, 0,05 О/, вторичного кислого фосфата калия, рН 7,0), культивируют при 28 С в течение 24 ч. Полученный питательный бульон используют в качестве затравочной культуры и инокулируют при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 содержании инокулума 2 О в питательную среду разведения, включающую, ,4: глюкоза 7; бактозиотон 4,4; вторичный кислый фосфат калия 0,32; вторичный кислый фосфат натрия 0,0852, И-трис-(оксиметил)метил-аминозтансульфоновэя кислота 1,15; хлористый кобальт 0,0001(рН 6,0), и затем осуществляют культивацию штамма ЯЕ при 28 С в аназробных условиях и при перемешивании. После культивации в течение 4 дн микробные клетки извлекают центрифугированием и промывают 50 мМ фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Затем зти клетки дезинтегрируют путем ультразвуковой обработки, после чего осуществляют центрифугирование с получением раствора сырого фермента.В указанный раствор сырого фермента вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксо- масляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл и Е-аспарагиновую кислоту до концентрации.200 мкг/мл. Осуществляют также контрольный опыт с использованием 2-кетоглутаровой кислоты в качестве контрольного субстрата для реакции трансаминирования, После протекания ферментной реакции при 30 С в течение 2 ч реакционный раствор нагревают при 100 С в течение 3 мин для завершения реакции,Величину рН полученного раствора доводят до 2 разбавленной серной кислотой. Раствор целевого продукта получают цент-. рифугированием данного реакционного раствора, Количество целевого продукта и глутаминовой кислоты, образующейся из кетоглутаровой кислоты, определяют с помощью аминокислотного анализатора,Получают: 1 -2-амино-(гидроксиметилфосфинил)-масляная кислота - 2,8 мкгlмл;2-Кб глутаминовая кислота 67,9 мкг/мл (контроль),П р и м е р 4. Используют штамм Ясгертовусез пуцгозсорсиз ИР(ЕЕВМ Р).В колбе Эрленмейера емкостью 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штамма Зтгерсотусез Ьу 9 гозсорсиз МР, культивированного в течение 3 дн, 30 мл водного раствора 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мг/мл; рН 7,0), 40 мл водного раствора :глутамата натрия (концентрация 170 мг/мл) и 10 мл молярного буферного раствора трис-НС (рН 8,5), Процесс ведут при осторожном взбалтывании полученной смеси при 37 С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь центрифугируют для удаления из нее микробных клеток,. а поверхностный раствор, содержащий целевой продукт, анализируют с помощью аминокислотного анализатора. Получают 14мг/мл 1-2-амино-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты,П р и м е р 5. Используют штаммЯтгертоаусез 11 ч 1 бапз 66 (ЕЕВМ ВР), 5В колбе Эрленмейера на 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штаммаЯтгер 1 оаусез Пчбапз 66, культивированного в течение 3 дн в питательной среде, 30 млводного раствора 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мг/мл, рН 7,0), 40 мл водногораствора 1-глутамата натрия (концентрация170 мг/мл) и 10 мл 1 молярного буферногораствора трис-НС (рН 8,5), При осторожном 15взбалтывании полученной смеси при 37 Сосуществляют ферментную реакцию, которая протекает в течение 24 ч, Затею полученную реакционную смесьцентрифугируют для удаления из нее микробных клеток, Полученный поверхностныйраствор, содержащий образующуюся 1-2 а мино-(гидро ксиметилфосфинил)-масляную кислоту (100 мл), анализируют с помощью аминокислотного анализатора с 25целью определения количества целевогопродукта. Получают 6 мг/мл 1:2-амино(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты,Ниже приведены результаты, полученные при использовании различных штаммов бактерий (табл. 2), дрожжей (табл, 3),актиномицетов (табл. 4), грибов (табл. 5), где61 ц - глутаминовая кислота, Азр - аспарагиновая кислота, 35В табл. 6 приведены результаты, показывающие зависимость выхода продукта отконцентрации И Н 2-донора и исходной оксокислоты.Формула изобретения 40Способ получения 1:2-амино-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты формулы11СБ-Р - СБ- СХГ -СН-. СООБ 45Оо т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюускорения процесса, проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствииглутаминовой или аспарагиновой кислот или их смеси в качестве ИН 2-донора и глутаминовая кислота - щавелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси, или штаммов-продуцентов укаэанных трансаминаз Ятгертоаусез Ьудгозсорсцз ЯЕ(ЕЕВМ ВР, АТСС 21705) или Ятгертоаусез Ьудгозсор 1 сцз МР (ЕЕВМ ВР), или Ятгертоаусез 11 чЫапз 66 (ЕЕВМ В Р), или Зтгертоаусез аЬцз ЕО 13014 (АТСС 3004), или Ятгертоаусез дг 1 зецз ЕО 12875 (АТСС 23345), или Ятгерто-ч 1 г 1 сИ 1 ца сппааопеца 1 ЕО 12852 (АТСС 11874 ), или Ятгероаусез аогоо 1 саепз 1 з ЕО 13416 (АТСС 19166), или йосагб 1 а аеб 1 теггапе АТСС 21271, или МосагбОрз 1 з баззолч 11 е 1 СМ 3237, или Ятгертоаусез ч гЫосЬгоаодепез СМ 4977, или Зтгертогпусез ч 1 гЫосЬгоаодепез 1 ЕО 13347 (АТСС 14925), или Мсгоаопозрога сагЬопасеае МВВ 2972 (АТСС 27114), или Езде г 1 сЫа со 1 АТСС 10798, или Рзецбоаопаз аегцдпоза АТСС 10145, или Рзецбоаопаз серасе АТСС 17759, или Яеггат 1 а аагсезсепз АТСС 13880, или Сапбда аЬсапз 1 АМ 4829, или Мцсог зрпезсепз АМ МиЗ при рН 8,0 - 9,0, температуре 28 - 50 С и молярном соотношении 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и ИН 2-донора 11-10.Приоритет по пунктам 9,04,86: проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии глутаминовая кислота - щавелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси, или штаммов-продуцентов указанных трансаминаз, ЗЕАТСС 10145, АТСС 13880, АТСС 9341.23.01.87: в присутствии глутаминовой кислоты в качестве КН 2-донора, штаммов ИР- ЕЕВМ ВР.30.03.87: в присутствии штаммов-продуцентов указанных трансаминаз 1 ЕО 13014, 1 ЕО 12875, ЕО 12852, 1 ЕО 13416, АТСС 21271, СМ 3237, СМ 4977, 1 ЕО 13347, ИВВ 1.2972, АТСС 17759, АМ 4829, АМ МиЗ,25.04.87: в присутствии аспарагиновой кислоты в качестве ИН 2-донора или их смеси.10 1731067 Таблица 1 Выход продукта в зависимости от штамма ица ход продукта при использовании бактери аблица ход продукта при использовании дрожже Таблиц Вых укта при использовании актиномицет ход продукта, мг/м тамм актиномицето ггергощусев а 1 Ьцв 1 ГО 130 АТСС 3004) 7 В ггерсощусев 8 ггвецв 1 РО 1 АТСС 23345) 7 8,3 ггергочеггс 1ГО 12852 (АТС 1 цщ. сппа 11874) опецщ 6 гергощусев щогооКаепввТСС 19166) О 13416 5 6 рвов даввопчП 1 е 1усев чггИосЬгощо 87 (АТСС 14925) 1 СИ 3 пев Мз.сгощ (АТСС 2 порога сагЬопасеа114) гг ИосЛгощо 8 ев 1 СИ 497 Бггергощус Носа гИ Носата Зггер го 1 ГО 133 щейггеггапе 1. АТСС 2127 6,8,1,4 5,61731067 Таблица 5 Выход продукта при использовании грибов.Таблица 6 Начальная концентрация ЙН 2-доно а,г/мл Начальная концентрация оксокислоты,мг/мл Выход продукта,г/мл Опыт-глютамат нат ия 1 -аспартат нат ия П р и м е ч а н и е: опыт 9 осуществляют при 50 С и рН 9,0, а опыт 11- при 45 ОС и рН 8,5,Ссставитель О.СкородумоваТехред М.Моргентал Корректор ТЯалий Редактор М.Келемеш ЗаКаз 1520 . Тираж. Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 10000 1000 10000 гОООО 30000 10000 10000 50000 50000 40000 40000 10000 200000 10000 30000 30000 100000 50000 150000 40000 40000 0