Способ определения количества х-хромосом человека

ихСКИ СОЮЗ СОВЕ СОЦИАЛИСТ РЕСПУБЛИК 9 И 1215/)5 С 01 Б 3 ТЕНИЯ ятрииихиитра пСР ТВА нсти аед асс на" омо- ля ледс ом, анн риал перв те ека ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт клиническоВсесоюзного научного це ческого здоровья АМН СС(57) Изобретение относится к медицинской генетике и может быть использовано для определения числаХ-хромосом в ранней пренатальнойдиагностике на материале биопсиихорина в первом триместре беременности и постнатальной диагностикена материале некультивируемых клетопериферической крови человека наследственных болезней, сцепленных сполом и связанных с численными бретение относится к медиценетике, в частности к обло"генетического консультиропренатальной диагностики ненных болезней, сцепленныхи связанных с численнымиями в системе половых Х-хрможет быть использовано дэкснресс-диагностики на мбиопсии хориона человекатриместре беременности илале периферической крови чеэ культивирования клеток. гнарутпениямй в системе Х-хромосом (синдромы Клайнфельтера, Тернера, трипло-Х) . 1 ель - ускорение н повышение точности способа, Сущность изобретения заключается в том, что клонпрованный фрагмент альфа-сателлитной ДНК человека используется в качестве ДНК-зонда для выявления Х-хромосом в интерфазных ядрах, позволяя в течение 2-3 дней определить число Х-хромосом на цитологических препаратах клеток человека при проведении гибридизации в следующих условиях: температура гиборидизации 42 С, продолжительность гибридизации 18 ч, состав раствора для гибридизации 50 Х формамида, 107 декстрансульфата 500; 0,15 М хлористого натрия, 0,015 М цитрата натрия и радиоактивной ДНК-зонда в концентрации 0,5 10импульсов в 1 мин в расчете на 20 мкл гибридизационной смеси. Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа.Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент альфа-сателлитной ДНК человека, специфически маркирующий Х-хромосому, ф, используется в качестве ДНК-зонда для дифференциального выявления Х-хромо- сом в интерфаэных ядрах илн метафаэ-. ных клетках человека, позволяя быст- ро и надежно определять число Х-хро"Фмосом на цитологических препаратахклеток человека в условиях п в 11 ц.Источником выделения маркерцогоФрагмента альфа-сятеллитцой ДНК (про.ба рУАМ 10/40 А) служт тотальнаяДНК человека, ныделенцая стандартнымиетодом цэ йеток плацецты. ПрепаратДНК человека обрабатывают рестриктазой РвТ 1 до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшинают" с помощью лигирования в сайт 10РнС 1 плазмидного вектора рцС 19 (раз.мером 2688 пар нуклеотидов) . Полученной после лигирования смесью, содержащей встроенные в плазмиду Фрагментыгецомной ДНК человека, трацсформируют 15бактериальные клетки Е.со 1 штаммВМН 71/17, Бактериальные клетки послетрансформации высевают ца селективнуюсреду Мак-Конки (фирма Дифко) дллвыращивания бактерий, позволяющей отбирать трансформированные клетки,содержащие плазмидную ДНК со вставкой ДНК человека. Это обусловлено тем,что плаэмида рБС 19 содержит сайт РнТ 125в районе гена синтеза р-галяктозидазы, который ицактинируется в результате встройки любого фрагментаДНК в этот сайт.Таким образом, ца селективной среде бактериальцые колонии, содержащиеплаэмиды со вставкой ДНК человека,окрашиваются в бельй цвет, я колониибез рекомбицантных плазмид - в красный. Следовательно, данный векторпозволяет создать рекомбицянтцую клонотеку и отобрать клоны бактериальцых клеток, содержащих встроенные вццх фрагменты ДНК человека.Для отбора бактерцальных клонов,содержащих плазмцды с альфа-сателлитной ДК человека, проводят гибридизацию колоний ца нитроцеллюлоэныхфильтрах с меченной Р-ДНК альфоидной ДНК человека размером 340 парцуклеотидов,который клоцнровац, секнениронац и отнесен к альфа-сдтеллитцой ДНК, Колонии, которые дают положительный сигнал ца рядцоавтографдх врезультате гибридизации, отбирают ииспользуют для определения хромосомцой локализации клоцированных рестриктных Фрагментов ДНК непосредственно в цитологических препаратах хромосом,Получеие,итологическх предрятон ицтерфаэцык и метдФачьа клеток,меченных трием образцов ЕЮК, игибрнЛиз ди чеч еьх рддод к ти,миредиГскдм рекомбдцтмх молекул ПК в условияхи з б, проводят, как описано н примере .П р и м е р. Тотальную ДНК че-ловека вьделли иэ клетокдцеты,Размельченную мехдццческц ткань помещалц в 2-Э-крдтцый объем 0,05 Мбуфера трисС 1 рН 9,0 и размельчали до получения клеточной суспензии,в гомогениздторе в течение 1 О с.К суспецэии клеток добавляли лизирующий раствор додецилсульфатя натрия до конечной концентрации 7.Раствор прогревали в течение 1 О минопри бО С, а затем проводили Фецольную и хлороформцую депротеиццэдцию.ДНК из раствора (водной Фазы) осаждают равным объемом эопропилоногоспирта в течениеч при - 18 С.оОсадок расторлют в буфере ТЕ (50 мМтрис-НС 1, рН 8, 0,5 мМ ЭДТА), содержащем 17-ы раствор додецилсульфата нд.трил (БМ) Длл удаления остаточных белков препарат обрабатывают протеицазой К (100 мкг/мл) нотечение 2 ч при 37 С, д затем повторно проводят Фецольную и хлороформцуюэкстракцню, как описано вышее. Препарат ДНК осаждают рдым объемом изопропилоного спирта, высуцинают,растворяют в буфере ТЕ в концентрации отдо 5 мг/мл. Для удаленияиэ препарата РНК, раствор нкубируютв течение 2 ч при 37 С с РНКязой вконцентрации 100 гlмл. Затем проводят Фецольцую и хлороформцую депротеициэдцию, осяждецие ДНК изопропиловым спиртом, как описано выше.ДНКрастворяют в буфере ТЕ и определяютконцетряцио ДНК с помощью спектрофотометра при волне 260 нм,ДНК рекомбинацтцыхплазмид длл получения гепомцой клоцотеки и дляскрицницга бактериальцых колоний вы-,деляют из 00 мл ночной культуры,выращивая бактерии ца среде ЬВ(10 г/л пептоца, 5 г/л дрожжевогоэкстракта, 1 О г/л ХаС 1 с добавлениемампициллица до концентрации 100 мг/мл).Бактериальные клетки из водной Фазыосаждают 2,5 объемами этиловогоспирта. Образцы ДНК растворяют вбуфере ТЕ и используют для лигирования и получения геномной кдонотекикак описано ниже.Компетентную культуру бдктерийлтамма ВН 71/17 готовят следующимобразом: в 25 мл питательной средыЬВ вносят 1 мл ночной культуры Е.со 1.1494 724 6выдерживают 1 ч при О С. Осадок получают пентрифугировднисм в течение20 мин при 14000 об/мин (роторБекман 2-2) Нддосадочную жидкость,содержащую плдзмидную ДИК, смешивают с равным объсмом хлороформиэоамилооого спирта (смесь в соотношении 24:1), энергично встряхивают и10 центрифугируют в течение 5 мин при2000 об/мин (ротор Бекмдн М,5) .Отбирают водную фазу и плдзмиднуюДНК осаждают рдвным объемом изоамилового спирта в течение 1 ч прно15 -8 С. Ссадос собирают центрифугнрованием в течение 10 мин при 5000 об//мин (ротор Бекмдн Я,5) и растворяют в воде. Затем ДНК персосажддк 1 тиэ водного раствора 2,5 объемами20 этилового спирта в течение 1 ч прио-18 С. Осадок собирают центрифугированием, промывают дваждь 1 70,".-нымэтиловым спиртом, высушивают и растворяют в 200 мкл буфера ТЕ.25 и вырдщивдют нд качалке до мутности А 5= 0,4-0,5. Деление клеток оста - навливают помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием в течение О мин при 5000 об/мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденногоодо 0 С раствора 1 ОО мМ СаС 1,клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мп100 мМ СаС 1 . Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М СаС 1 с 157. глицерином. После инкубации полученной суспензии при О С в течение 30 мин, культура готова к трансформации. Культуру хранят при -80 С.К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0 С добавляют О, - 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой же температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню с температуройО42 С на 60-90 с и снова помещают на лед, К трансформированной культуре добавляют до 1,5-2 мл жидкую питательную среду ЬВ и подращивают нд ка чалке 2 ч при 37 С. Трансформированные клетки высеивают на селективную среду Мак-Конки (по 0,1 кп культуры на чашку Петри со средой в 1,57. агаре) с добавлением ампициллина.Для идентификации колоний бактерий, содержащих плазмиды со вставками ДНК человека, и окрашенных в белый цвет, их наносят репликой на нитроцеллюлозные Фильтры, находящиеся на поверхности чашек Петри с твердой питательной средой ЬВ. Выросшие в течение суток при 37 С бактерии вместе с Фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 Н МаОН и оставляют на 5-10 мин, Подсушив, осаждали из 00 мл ночной культуры в течение 10 мин при 6000 об/мин центрифугированпем.Осажденные клетки ресуспендировали в 10 мл буфера, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-НС 1, рН 8,0 и 2 мг/мл лизоцима, После 15-минутной инкубацин при комнатной температуре добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора 0,2 Н ИаОН и 13-ный додецилсульфат натрия. После тщательного перекешивания и 5 мин инкубации при О С добавляют , 15 мл раствора 3 М ацетата натрия, рН 4,8, тщательно перемешивают и Эндонуклеаэную обрдботку ДК человека и бактериальной плазмцдырЫС 19 проводят в буфере, содергдщем1 О мМ трис-НС 1, рН 8,0 О мИ ВдС 1, 30 О мМ МеС 1иМ дитиотрейтела.Время полного гидролпзд рестрик гдзой РзС 1 в копцентрдции ) л/мкгДНК составляет 4 ч в случае нлдзмидной ДНК и 18 ч в случде ДНК человека.Реакция останавливается добавлениемРавного объема фенола, После фенольной и хлороформной депротеинизацииводная Фаза трижды промывается водонасыщенным эфиром, и ДНК фильтр с 40 нижней стороны фильтровдльной бумагой,дважды по 10 мин его обрабатываютраствором 1 М трисС 1, рН 8,0, затем 1,5 И раствором ИдС 1 с 1 М трисНС 1, рН 8,0 в течение 1 О мин, Высу" 45 шенный фильтр помещают в раствор258 С с протеиназой К в концентрации50-100 мкгlмл и инкубируют в нем при37 С в течение 1 часа. Далее фильтрпромывают в 0,3 М ЬаС 1, а затем высу-, 50 шивают под вакуумом 80 С в течение2 ч.Образцы ДНК для гибридизации нафильтрах с колониями нли на хромосомах 1 п в 1 Сц метят изотопной меткой 55 методом замещения: в 190 мкл водырастворяют последовательно 15 мклдесятикратного буфера (0,8 М трисНС 1, рН 7,4; 0,1 М ИеС , 0,05 Идитиотрейтола), 5 мкл нерадиоактив 1494724цых дезоксицуклеозидтрифосфдтон (по 0,02 М каждого), 5 мкл ДКдзы 1 (концентрация 1 мкг/мл), 5 мкл ДИК- полимераэы 1 (коццентраццл 0,5- 2 ед/мкл), 10 мкл меченного тритием (для гибридизации ш я).ц) или Фосфором (гибридизация колоний) одного из дезоксинуклеозидтрифосфдта и но- ды до конечного дбъема 150 мкл, Реакцию ведут н течение 20-40 мин при 20 С, Средняя удельная радиоактивность составляет около 2,5 л 10импульсов в 1 мнц н расчете ца 1 мкм ДПК н случае трития и около 2,510 " им пульсов в 1 мин н случае фосфора (э Р) .Перед гибридизацией фильтр с колоо ниями бактерий вымачцндют при 67 С н растворе 6 юББС; 0,5 Х Б 1)Б; 0,1 Х 20 фиколлц 0,1 Х цолифенцлпцрролидоц н течение 60-90 миц, Вслед зд этим фильтр насухо промакают Фильтровдльцой бумагой и помещают в 5 мл гибридиздциоццой смеси, содержащей бфББС, 0,1 БОБ, 10 Х декстрансульфата, 50 мкг/мл поли-А ц денатурированную ЯР-пробу с суммарной активностью 1 -5 1 0 имп/миц, Гибридизациюьпроводят прц 67 С н течение 18 ч. ЗО Фильтры промывают и нескольких сменах 2 ББС с 0,1 БРБ при комнатной температуре н течение 20 миц, а затем при 42 С в 0,1 ББС и 0,1 . БОБ в течение 15 миц. Фильтры высушивают 35 и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ. 1 ерез 24 ч экспозиции пленку проявляют и рддцоавтогрдфнчески идентифицируют гибридные клоны по наличию положительных сигналов 40 (здснечинание Фотозмульгии при контакте с участкдми гибридизации Р-меченной ДНК).Предлагаемым способом ставят опыт с клонотекой цз различных фрагментов 45 Ря 1 1 ДНК человека, Прц этом в кдчестне зонда длл гибридизации цд колониях берется проба дльфоилцой ДК человека, препдрдтинцо ныделеццдя и.з состава клонцрондццого ГсоР, 1 лРаг.мецча альфоидной ДНК сЮрон, Яковлев, Зайцев и др. 986). В указднцый образец альфоцдцой ЛНК вводится цзотоццал метка предлагдемлсм метосол замещения, После гибридизации цд колециях особенно четко обиду инаетслсит цдл ца нескольких колониях, одцдиз которых получила цязнГцие р УАМ10/4)Л, соответственно ее цорллконг. му номеру н цг.ходцой клоцотеке. Реколбиндтцдл цлдзмидд р УАМ 1 О/40 Адля специФического ларкиронднил хромосомы Х человека состоит из фрагмента Ря 1 векторной плдзмиды размером 2,7 тыс.п.н. и фрагмента Ря 1хромосомной ДПК человека размером2,0 тыс.п.ц,Препдраты хромосом для гибридизации ).и я 1 сц готовят из культивируемых лимфоцитов периферической крови,стимулированных к делению с помощьюфнтагемдгглютиццна (Фирма ДИФКО,СШЛ), Культиниронание проводят в пенициллцноньгх флаконах н среде Игла сдобанлеццем до ОХ сыворотки крупногорогатого скота н течение 72 ч .Затемдобавляют колхицин до конечной кон-,центрации 0,20 мкг/мл, Клетки в среде культивирования переносят н цент-.рифужцые пробирки и цецтрифугируют втечение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспецдируют в гипотоническомрастворе 0,075 М КС 1 и инкубируют. вотечение5 мин при 37 С. Фиксациюклеток проводят метанол-уксуснымФиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Клетки раскапываютсяна предметные стекла и высушиваютца ноздухе.Гибридизацию п яТы меченной ра"диоактивными предшественниками рекам.бинантцой ДНК р УАМО/40 А проводят спредварительной денатурацией метафаэных и цнтерфазных хромосом в течение 30 с в 0,07 Н 1 аОН с последующим промыванием препаратов по 5 мини 70 и 96 -цом этаноле, Препаратырадиоактивно меченных рекомбицантныхплазмид денатурируют нагреванием при100 С и течение 10 мин в гибридизациоццой смеси, содержащей 50 Х формамида, 2 ББС, 1 Одекстрансульфата 500 и до 1-210 имп/мин. радиоактивной ДНК. Гибридизацию проводятпри 42 С н течение 18 ч . Препаратыпосле гибридизации промывают в 4сменах 2 ББС при 37 С по 5 мин вкаждой смене, затем в 70 и 96 Х-иомспирте по 5 мнн и высушивают на воздухе. Препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте1-3 дня. После проявления стандартным Фотопролнителем препараты окрашивают красителем Гимэа. Радиоантографы хромосом анализируют и фотогрдирут при увеличении микроскогд250 ", 1494724Гибридиздггияи н 1 Тп цд метдг 1 газггг,гххромосомах показывает, что кггоциронаццый ф 11 дглгеггт р УЛ 11 1 О/40 Л ггоггдли-зуется только в прицецтромерцом рай 5оце хромосомы Х и специфически маркирует данную хромосому,П р и м е р 2. Применение рекомбицдцтной плдзмиды р УЛИ 1 О/40 Л дляопределения числа хромосом Х в метафдзных и интерфазных клетках индивидов мужского пола (кариотип 46, ХУ),женского пола с нормальным кдриотипом (46, ХХ) индивида с мозаичнымкариотипом 45,Х/46,Х изоХ (мозаичный 15случай синдрома Тернера), ицдивидас кариотипом 49, ХХХХУ (синдромКлайнфельтерд) было проведено цапрепаратах лггмфоцитов, как оиисдцо нпримере 1. Все процедуры по гибриди1здции п в 11 и, включая введение метки в плазмиду р УАИ 1 О/40 А, децатурдцию Д 1 К, условия гибридизации ианализа препаратов, повторяются аналогично примеру 1 . Отггггчия состоятлишь н том, что н этом примере используются клетки индивидов с разнымсодержанием хромосом Х.С помощью Д 11 К р УАИ 10/40 А н клетках мужчины, содержащих одну хромосому Х, выявляется одно крупцое скопление иэотопной метки, соотнетстнующей единственной хромосоме Х кдк в метафазных, так и интерфаэцых хромосомах. В клетках женщин, содержащих 35две хромосомы Х, выявляются Цва скопления метки, соответствующих двумженским хромосомам Х, Анализ метафазных и ицтерфазцых клеток индивида с мозаичным кариотипом 45, Х/46, 40Х изоХ значительно облегчается прииспользовании маркерцой илазмидыр УЛМ 1 О/40 А. При этом удается безприменения методов дифференциальногоокрашивания хромосом по длине и детального кариотипированця большогочисла метафаэных пластинок, выявитьклетки с одной и клетки с двумя хромосомами Х. Впервые создается воэможность надежно определить число 5 Охромосом Х в интерфдзных клетках иопределить долю клеток с разным числом хромосом Х при моэдицизме. Этоособенно важно для анализа обраэцондифференцированных клеток разных 55тканей, которые це способны к делению,и, следовательно, провести стандартный анализ хромосом с помощьюразличных методов онрдигивания не 13 редг тдяггяет н поэм ожггг 1 гм, Лггдлггч иц - терфдзцых клеток индцнипд с кдриотипом 49, ХХХХУ одцоэидчцо показывает наличие н большинстве клеток 4 скоплеццй метки соотнетстнуюгпих хромосомам Х. Следовательно, плаэмида для мдркирондция хромосомы Х позволяет надежно пронглить диагностику различных ндриднтов иолисомий по числу хромосом Х, н частности, часто встречающихся синдромон Церешевского Терцерд и Клдйцфельтерд.П р и и е р 3. Важной иллюстрацией практического применения мдркерной плдзмиды р УЛИ 10/40 А для пренатальной диагностики поля или численных нарушений н системе хромосом Х служит ньгягленце хромосом Х в клетках, цолучеццьгх из материала биопсии хариоцд плода в пернгм триместре беременности.В этом случае хромосомы Х выявляют в цеделящихся, ндтинных клетках норсигок хориоцд, полученных нд 7-8 неделе беремеццости, Препараты интерфдзцых ядер готовят методом "отпечат1 гов , для чего плотно прижимают биопсийггьй материал к поверхности чистого сухого предметного стекла в нескалькггх местах, н результате чего отдельные клетки прикрепляются к стеклу. Клетки фиксируют в течение 15 мин в метанол-уксусном Фиксаторе (3:1) и высушивают ца воздухе. Процедура приготовления препаратов клеток хориона для последующей диагностики занимает при этом способе це более 30 миц. Альтернативный способ получения цитологических препаратов заключается в сусиецдировании клеток хориоцд в гипотоцическом растворе 0,075 М КС 1 при комнатной температуре. После 15 мин воздейстния гипотоцическим рдстнором клетки фиксируют дважды метанол-уксусным фиксатором (3:1) и раскапывают ца предметные стекла, как в примере. Гибридизация 1 п в 1 Сц клеток хориона, с маркерной плазмидой проводится,как в приме ре.Микроскопический анализ реэультатон гибридизации показывает наличие в клетках одной или двух хромосом Х, что соответствует мужскому или женскому кариотипу, В этом способе диагностики удается определить число хрО- мцсом в неделящихся клетках ворсинок хориона в течение 2-3 дней. Альтернативные методы диагностики пола при12 11 1494724 пронедении пренатальной диагностикизанимают 2-4 недели при испольэонании методов хромосомного анализа вслучаях культивирования клеток хориЪ6 ца или амниотической жидкости.Таким образом, клонироваццая последовательность ДДК р ТАМ 1 О/40 Л позволяет эффективно маркировать половую хромосому Х человека, что создает возможность для молекулярно-цитогеиетической диагностики пола н пер- вом триместре беременности (8-10 недель) в случаях наследственных боФормула пеэней, сцепленных с полом. Благода ря точности и быстроте метода правильный диагноз можно поставить вкороткий срок. Кроме того, применяяэтот способ, можно точно и быстродиагностировать наследственную патологию, снлзаццук с гпленцыми нарушениями в системе половых хромосом,включал такие часто встречаемые типы хромосомной патологии, как синдромы Ц 1 ерешевского - Териера (различные формы), Клайнфельтера (различные Формы), трипло-Х, а такжесложные случаи мозаициэма по этим заболеваниям.Ограничения предлагаемого способа с использованием интерфазцых ядер при проведеши пренатальной диагностики связаны с анализом ицдивидонс кариотипами 46, ХУ (нормальный мужчина) и 45, Х (синдром Тернера), атакже 46, ХХ (нормальная женщина) и 47, ХХТ (синдром Клайнфельтера) . Вэтих случаях при специальцьм показакиях необходимо проводить анализ метафазных хромосом. Использование предлагаемого способа позволяет отказаться н случае анализа метафаэных хромосом от методон дифференциального окрашивання, поскольку половые Х-хромосомы эффективно маркируются радиоактивной меткой, При проведении 10 постцатальцого определения числаХ-хромосом, когда пол индивида уже известен, ограничений для применения метода цет. и з обретения Способ определения количестваХ-хромосом человека путем фиксацииклеток пациента с последующим подсчетом Х-хромосом, о т л и ч а ю - 20 щ и Я с я тем, что, с целью ускорения и поньппения точности способа,фиксируют интерфазные клетки, которые дополнительно обрабатывают0,07 И едким натром н течение 30 с,затем к цим добанллют радиоактивныйДК-зонд и ицкубируют до 18 ч прио42 С н среде, содержащей солевойраствор 0,3 И хлористого натрия,0,03 И цитрата натрия, 503 формами- ЭО да, 103 декстрансульфата, далее отмывают в том же растворе при физиологической температуре в четырехсменах раствора по 5 мин, покрываютпрепараты фотозмульсией, проявляют 35 через 1-3 дня и подсчитывают числомаркиронаццых радиоактивной меткойХ-хромосом н интерфазных ядрах клеток пациента.1 Составитель А, Скурат Техред А.Кравчук Корректор И. Муска Редактор С, Юекона Заказ 671 Тираж 422 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская цаб., д. 4/5 Производственно-цзлательскй кицлт "Патеит", г.ужгород, ул. Гагарина,101