Способ получения пептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ИЗО ОПИ И ПАТЕНТУ лоджи рнестРБьюзс Гуйлред19 975. СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ИОТКРЫТИЙ(71) Дэе Салк Институт фор Бикал Стадиз (118)(72) Питер Болен (СН),.Поль ЭБраво (СА), фредерик Стефан ЭНиколас Чай-Ван Линг, ВильямВеренберг и Роджер Ч;рльз Луилемин ЖБ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности соединений общей ф-лы Н-ТУК-А 1 а-Азр-А 1 ае-РЬе-ТЬК-АяИ-БеК-ТУК-АКя-Ьув- К, -Ьец-С 1 у-С 1 И-Ьец-БеЬ-А 1 а-АКд-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 И-Аяре-Ме-К -АКя-С 1 И-С 1 у-С 1 ц-С 1 ц-АКяИ-АзИ-С 1 И-С 1 у-С 1 И-С 1 У-А 1 а-К -Ча 1-АКе 41 -Ьеу-У, где У - ОН или ИН, К, - Ча 1 или 11 е; К - БеК или.АяИ; К 4, - АК 8 или Ьуз, которые обладают способностью промотировать выделение гормона роста, что может быть использовано в ветеринарии. 1 ель - создание новых более доступных и менее токсич 1) 4 С 07 К 7/10 А 61 К 37/ ных пептидов, Их синтез ведут из замещенного группой Вос лейцина, который связывают с метилбенэгидриламиновой смолой (МБГАС) или хлорметилированной смолой (из расчета 1 ммольаминокислоты на 1 г смолы) в средехлористого метилена и/или диметилформамида. Затем удаляют Вос-группуи к полученному Ьец-полимеру присоединяют аминокислоты в необходимойпоследовательности. Получают пептидную смолу общей ф"лы Х,-ТУК(Х) -А 1 а-Аяр(Х)-А 1 ае-РЬе-ТЬК(Х)-АяИ-БеК-АКя (Х ) -АзИ-С 1 И-С 1 ц (Х ) -С 1 И-С 1 у-А 1 а-К 1 (Х ) или Х - Ча 1-АК 8(Ху)Ьец-Х, где Кц, Кяи К 4, см, вы-"ше, Х, - Вос, Х- 2,6-дихлорбенэил,Х - бензиловый эфир, Х 4- бензил, Х -тозил, Хб- хлорбенэилоксикарбонил;Х- -ОСН-хлорметилированная смолаили ИН-МБГАС, В этой смоле отщепляютзащитные группы и полимерный носительс помощью СРСООН в хлористом метилене с последующей обработкой НР в при;сутствии анизола и/или метилэтилсульфида при (-20)-0 С. Новые пептиды всравнении с природным пептидомРФГРТ(1-44)ИН обеспечивают 707"нуюактивность при малой токсичности,причем указанный способ позволяетполучать пептиды, выделяющие гормоныроста состава, характерного для определенного вида животных, 1423000Изобретение относится к способ", получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в ветеринарии.5Цель изобретения - повышение доступности соединений пептидной природы, малотоксичных и обладающих свойством стимулировать высвобождение1 О гормона роста гипофизом. П р и м е р 1. Синтез свиного ГРФ (1-44) ОН формулы:Н-,:Тир-Ала-Асп-.Ала-Иле-Фе-Тгр-Асн- -Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей-Гли-Глн- -Дей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп- -Иле-Мет-Сер-Арг-Глн-Глу-Гли-Гли- -фрг-Асн-Глн-Глу-Глн-Гли-Ала-Арг-Вал-Арг-Лей-ОН проводят ступенчато, используя синтезатор пептидов Бекман 990 на хлорметилированной смоле, выпускаемой фирмой 1.аЪ.БузТевз. 1 ас, содержащий 0,9 мэкв С 1/г. Осуществляют присоединение БОК-Лей к смоле, при этом замещается приблизительно2 э О 22 ммоль Лей на 1 г смолы. Все раствОрители, которые при этом используются, тщательно дегазируют путем барботирования инертным газом, предпочтительно гелием, чтобы быть увеЗО ренным в отсутствии кислорода, который может приводить к нежелательному окислению серы в Мет в остат.После снятия защиты и нейтрализации пептидную цепь строят шаг за 35 шагом на смоле. Связывание точно проводят в соответствии со схемой, приведенной в таблице.Для реакции связывания 1 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хло ристом метилене используется на 1 г смолы плюс 1 экв 0,5 М дициклогексилкарбодегимида (ДЦКИ) в хлористом ме- тилене или 307-ный ДМФ в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Арг 45 связан, используют смесь 107-ного ДМФ " хлористого метилена, Бензил (Бэл) используют в качестве защитной группы гидроксильной боковой цепи Сер и Тгр. 2-хлорбензилоксикар- :, бонил (2 С 1-2) используют в качестве защитной группы боковой цепи Лиз. .Тоэил (Тоз) используют для защиты гуанидино-группы Арг и карбоксильная группа Глу или Асп защищена, как бен:-:,., ,эиповый эфир. Фенольная гидроксиль,ная группа Тир защищена 2,б-дихлорбензилом. В конце синтеза получают пептидную смолу следующего состава; Х, -Тир(Х) -Ала-Асп(Х )-Ллз-Иле-Фе-Тгр (Х 4)-Асн-Сер (Х) -Тир (Х ) -Арг(Х 6) -Лиз (Х 7 ) -Вал-Лей-Гли-Гл н-Лей-Сер (Х ) -Ала-Арг (Х) -Лиз (Х т) -Лей-Лей-Глн-Асп (Х з) -Иле-Мет-Сер (Х) -Арг(Х ) -Глн- Глн-Гли-Глу (Хз) -Арг (Х 6) --Вал-Арг (Хв) -Лей-Хв,где Х, - Вок;Х - 2,б-дихлорбензил,Х - бензиловый эфир;Х 4 - Бэл;Х - Тос,Х. - 2 С 1-2;Хв - -О-.СН -бензолполистирол смолистый носитель.После окончания .остаток Тир связывают со смолой, Вос-группу удаляют453-ной трифторуксусной кислотой вхлористом метилене (ТФУ в СН С 1 ).Для расщепления и снятия защиты с ос:тавшейся защищенной системы пептицсмола, пептид обрабатывают 1,5 йпанизола, 0,25 мп метилэтилсульфида и10 мп фтористого водорода (НР) наог пептид-смола при -20 С за полчаоса и при 0 С за полчаса. После удаления НГ при высоком вакууме остатоксмола-пептид промывают попеременносухим диэтиловым эфиром и хлороформом, и пептид затем экстрагируют дегазированной 2 н, водной уксуснойкислотой, При лиофилизации уксуснокислого экстракта получают белый пушистый материал. Расщепленный, лишенный защиты, пептид затем растворяют в 307-ной уксусной кислоте и подвергают мелкозернистой гель-фильтрации, используя фильтр Сефадекс С.Затем пептид дополнительно очищают с помощью СМкарбоксиметилцеллюлозной катионообменной хроматографии (1,8 х 18 см, Ч; = 50 мл), ис альзуя вогнутый градиент, вызываемый введением по каплям 1 л 0,4 М МН 4 ОАц, рН 6,5 в смешивающую колбу, содержащую 400 мп 0,01 М ИНОАц, рН 4,5, Окончательн"ю очистку проводят, используч распределительную хроматографию на Сефадексе Сс мелкозернистым носителем (РЬаппас 1 а) с н-БуОН",ЭСОН. Пиридин: О 9 2 Б н. МНфОАЦ ( 1 е 1: /) астворительной системой, Хроматографические фракции тщательно контролируют тонкослойной хроматографией (т.с.х) и только те фракции, которые1423000 оказывались существенно чистыми, отбирают.Пептид свиной ГРФ (1-44) Я 1 сД (С:1, в 17-ной уксусной кислоте)64,2 + 1, выход 395,2 мг (из 6 г смолы получено 9,5 г пептидной смолы и 395,2 мг пептида).Синтез повторяют, используя МБГА смолу, чтобы получить тот же пептид, имеющий амидированный С-край.Пептид свиной ГРФ (1-44)ОН: 03 в(С:1 в 17.-ной уксусной кислоте) 66,2+1, выход 704,4 мг (из б г смолы получено 9,80 г пептидной смолы) .1П р и м е р 2. Синтез бычьего ГРФ (1-44) формулы Н-Тир-Лла-Асп-Ала-Иле- Фен-Тре-Асн-Сер-Тир-Арг-Лиз-Вал-Лей- Гли-Глн-Лей-Сер-Ала-Арг-Лиз-Лей-Лей- Глн-Асп-Иле-Мет-Асн-Арг-Глн-Глн-Гли- Глу-Арг-Асн-Глн-Глу-Глн-Гли-Лла-ЛизВал-Арг-Лей-МН проводят постадийно с применением пептидного сингезатора Бекмана 990 и 6 г смолы МБГА. Реакцию сочетании Вос-Лей с молекулой этой смолы проводят в течение 2 ч в хлористом метилене с использованием трехкратного избытка Вос-Лей и СС в качестве активирующего агента, в результате чего происходит замещение приблизительно Г,2-0,6 ммоль Лей на каждый 1 г смолы, связанной амидной связью с аминогруппами смолы МБГА. Все используемые растворителя тщательно удаляют барботированием инертным газом, предпочтительнее гелием, с целью обеспечить отсутствие кислорода, который мог бы вызвать нежелательное окисление серы в Мет-остатке.После удаления защитных групп и нейтрализации на молекуле смолы шаг за шагом строят пептидную цепь. Операции сочетания, удаления защитных групп и нейтрализации проводят как . описано в примере 1.Для реакции сочетания используют по 1 июль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене на каждый 1 г смолы плюс по 1 экв 0,5-М ВСС 1 в хлористом метилене или 307 ДМФ в хлористом метилене, продолжительность реакции 2 ч. В реакции сочетания аргинина используют смесь 107 ДМФ с хлористым метиленом. В качестве группы, запрещающей боковую гидроксильную группу цепи в молекулах серина и треонина, используют бензин. Для боковой цепи лиз:.на в качестве защитной группы используют 2-лорбензилоксикарбонил. Тозил используют в качестве защитной группыгуанидиновой группы аргинина, а кар5боксильные группы глутаминовой иаспарагиновой кислот защищают в виде ВЕ 1-эфира. Фенольную гидроксильн ю груп.у тирозина защищают 2,6-ди 10 хлорбензилом. По завершении синтезапол,чают продукт следующего соста .а:Х-Тир(Х)-Ала-Асп(Х )-Лла-Иле.Фен-Тре(Х) -Лмн-Сер(Х ) -Тир (Х)- Арг(Х)-Лиз(Х)-Вал-Лей-Гли-Глн-Лей 15 Сер(Х) -Ала-Лрг(Х 6)-Лиз(Х 7) -Лей-ЛейГлн-Асп(Хз)-Иле-Мет-Асп-Асн-Арг(Х) -Глн-Глн-Гли-Глу(Х)-Арг(Х 6) -Лсн-ГлнГлу(Х )-Глн-Гли-Ала-Лиз(Х. )-Вал-Арг(Х )-Лей-Н-МБГА-полистирольный поли 620 мерный субстрат,где Х, - Вос,Х - 2,б-дихлорбензил;Х - бензиловый эфирх 4 вк 125 Х - В 1Х - Тоз6 ФХ - 2 С 1-К.После конечного сочетания остаткатирозина с молекулой смолы Вос-группу удаляют с использованием 457-ногоТГФ в хлористом метилене с получением19,4 г системы пептид-смола. С цельюотщепления и удаления блокирующихгрупп от защищенной системы пептидсмола 1 О г этой последней обрабаты 35Фвают 10 мл анизола,2,5 мл метилэтилсульфида и 90 мл фтористого водородапри температаре -20 С в течение поолучаса и при температуре 0 С в тече 40 ние также получаса. После удаленияфтористого водорода в глубоком вакууме смоло-пептидный остаток промывают попеременно сухим диэтиловымэфиром и хлороформом, а затем пептидэкстрагируют дегазированным водным2 н. раствором уксусной кислоты. Врезультате лиофилизации уксуснокислотного экстракта получают белый рыхлый материал.Далее отщепленный и освобожденныйот защитных групп пептид растворяютв 307-ной уксусной кислоте и подвергают фильтрованию с использованиемтонкодисперсного геля Сефадекс С.Затем пептид подвергают дальнейшейочистке катионообменной хроматографией с использованием карбоксиметил.целлюлозы СМ(1,8 х 18 см; объемслоя 50 мл) с применением вогнутого423000 5 10 15 20 2 ъ 30 3 д 40 ;50 5градиента,который создают прикапыванием 1 л 0,4 М раствора ацетатааммония с величиной рН, равной 6,5,в:,.смесительную колбу, в которой содержится 400 мп 0,01 М раствора азотааммония при величине рН, равной 4,5.Конечную очистку проводят с применением распределительной хроматографической обработки на тонкодисперснойподложке Сефадекс С(РЬагпгасг.а)с помощью растворительной смеси н-бутанола с этанолом, пиридином и 0,2% н.уксусной кислотой в соотношении 4:1:: 1;7. Хроматографические фракциитщательно проверяют тонкослойнымжидкостным хроматографическим анализом, объединяя только те фракции, котсфые характеризуются существеннойстепенью чистоты., Выход бычьего ГРФ (1-44) ИНг261 мг (из 3 г смолы),Ы 3 (С:1, в13-ной уксусной кислоте) -64,0+1., Используя. хлорметилированную смол 5, получают бычий ГРФ (1-44) ОН свьходом 128 мг (из 1 г смолы),ОЛр-64,0+ 1,П р и м е р 3, Синтез овечьегоГРФ (1-44) ИН формулы:Н-Тир-Ала-Асп-Ала-Иле-Фе-Тр-Асн-СерТир-Арг-Лиз-Иле-Лей-Гли-Гли-Лей-СерАла-Арг-Лиз-Лей-Лей-Глн-Асп-Иле-ИетАсп-Арг-Глн-Глн-Гли-Глу-Арг-Асн-ГлнГлу - Глн-Гли - Ала-Лиз-Вал-Арг-Лей-МН,.опроводят ступенчато, используя синтезатор марки Бекман 990 и МБГА смолу, как указывалось в примере 2. В:;сенце синтеза получают пептидную смолу следующего состава:Х,-Тир(Хг) - Ала-Асп(Х )-Ала-Иле-ФеТгр(Х 4)-Асн-Сер(Х)-Тир(Х)-Арг(ХБ)Лиз(Хг)-Иле-Лей-Гли-Глн-Лей-Сер(Х)"Ала-Арг(Х)-Лиз(Х )-Лей-Лей-Глн-Асп(Х. )-Иле-Мет-Асн-Арг(Х)-Глн-Глн-ГлиГлу (Х ) -Арг (Хд)-Асн-Глн-Глу (Х ) -ГлнГли-дла-Лиз (Хг ) -Вал-Арг (Х ) -Лей-Хв,где Х - Бок,Хг - 2,6-дихлорбензил,Хз - сложный бензиловый эфир;Х - Бэл,Х - Бэл,Х Тос,Х - 2 С 1-ЕУХ - ИН-МБГА смолистый носитель,ЬПосле завершения синтеза остатокпр соединяют со смолой, Бок-группу.даляют 457 ТФУ в СН С 1 г.Расщеплениеснятие защиты оставшейся защищенной с стемы пептид-смола проводят какуказывалось в примере 2. Расщепленныйи лишенный защиты пептид растворяютв 30%-ной уксусной кислоте, подвергают мелкозернистой гель-фильтрации спомощью Сефадекс С, катионообменной хроматографии и в заключение распределительной хроМатографии, какуказывалось в примере 1.Выход овечьего ГРФ (1-44) МНгг197 мг (исходя из 3 г смолы), сгнив-62,0+ 1.Синтез повторяют, используя хлорметилированную смолу чтобы получитьтакой же пептид, имеющий свободныйкислотный С-край, следуя процедуре,описанной в примере 1,Выход овечьего ГРФ (1-44) ОН186 мг (исходя из 1 г смолы)Ы 3 д-64,0+1,Проведены биологические испытания синтезированных пептидов.Определена эффективность этихпептидов при освобождении гормона роста в анализах п чг.Сго. Опыты провобрились с гипофизарной клеткой, Используемые культуры включают клетки гипофиза крысы, удаленного предварительно за 4 или 5 дней. Инкубацию с веществом, подлежащим испытанию, проводят в течение 3-4 ч и аликвоты культуральной среды удаляют и абраба:. тывают таким образом, чтобы измерить содержание в иммунореактивном ГР с помощью хорошо разрешимого радиоиммуноанализа, Результаты этих сравнительных испытаний показывают, что в эквимолйрных отношениях пептид:1 свиной ГРФ (1-44) ИН, гдеВал; К - Сер; К, - Арг, имеет внутреннюю биологическую активность природного пептида РФГРГ (1-44) ИНг.11 бычьей ГРФ (1-44) ИНг, где Й., - Вал; Кг - Асн; К, - Лиз, и 111 овечьего ГРФ (1-44) ИНг, где З- Иле; Нгб- Асн, Н, - Лиз, имеют активность, составляющую 70% от активности природного пеп.яда РФГРГ ,1-44) ИНСпособы относятся к малотак:ичным веществам.Испытания пептидов в кислой форме показали, что они обладают близкой биологической активностью.Проведенные опыты хп ч.о подтвер - дили, что пептиды, полученные в условиях описываемого способа, могут( раз) 20 0,5 СНС 1 промывка (3 раза)СН ОН промывка (2 раза) быть отнесены к категории малотоксичных соединений.Предлагаемый способ позволяет получать новые биологически активные соединения - близкие аналоги по структуре и действию к природным соединениям, но более доступные, Синтез таких соединений позволяет получать пептиды .с последовательностью аминокислот фактора, высвобождающего гормон роста, состава, характерного для определенных видов животных. Таким образом, осуществление предлагаемого способа делает доступным синтетические варианты природных гормонов, что позволяет вводить в организм разных животных соответствующие их виду синтетические гормоны для достижения конкретных целей. Формула и э о б р е т е н и я Способ получения пептидов общей формулы 1Н-ТуК-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТпК-АвЫБеК-ТуК-АКя-Ьуя-К, -Ьец-С 1 у-С 1 И-ЬецБеК-А 1 а-АКв-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 М-АвреМеС-К "АК 8-С 1 Я-С 1 у-С 1 ц-С 1 ц-АК 8-АвИС 1 И-С 1 у-С 1 И-С 1 у-А 1 а-К,-Ча 1-АК 8-Ьеу-У,где У - ОН или ИН,;К, - Ча 1 или 1 е;Кгв БеК или АвН;К 4, - АКД или 1.уя,отлпчающийся тем,что,вводят во взаимодействиеммольВос-Ьсц сг МБГА или хлорметилированной смолы в хлористом метилене,или лиметилформамиде, или их смеси,удаляют Вос- защиту и к полученномуЬец-полимеру присоединяют оставшиесяаминокислоты в последовательности,отвечающей общей формуле 1, полученное соединение общей формулы 11Х,-ТуК(Х)-А 1 а-Аяр-(Х)-А 1 ае-РЬеТЬК(Х 4)-АяИ-БеК(Ху)-ТуК(Х ) - АК 8(Х )- Ьуя (Х ) -К,-Ьец-С 1 у-С 1 И-Ьец-БеК(Х 4) -А 1 а-АКд (Х ) -1 уз (Х ) -Ьец-Ьец-С 1 Х-Авр(Х) - Ьец-ХТ,где Х, - Вос;Х - 2,6-дихлорбензилХ - бензиловый эфир;Х 4 - бенэил,Х - тозил;25 Хв - хлорбензилоксикарбонил,Х - -ОСН- хлорметилированнаясмола, ИНМБГА,деблокируют и отцепляют полимер-носитель с использованием трифторуксусной30 кислоты в хлористом метилене с последующей обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии аниэола, метилэтилсульфида илиих смеси при 0 - 20 С.оПриоритет по признакам:1423000 107-ный триэтиламин (ЭтИ) в СНС 1,нейтрализация (2 раза) 0,5 СН ОН промывка (2 раза) 0,5 10%-ный триэтиламин (ЭтзМ) в СН С 1нейтрализация (2 раза) 0,5 СН ОН промывка (2 раза)СНС 1 промывка (2 раза) 10 0,5 ФБок-аминокислота (1 ммоль/г смолы) плюс эквивалентное количество дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в СН,С 1,120 СН, С 1 промывка ( 1 раз) 0,5 507,-ный диметилформамид в СН С 1(промывка.2 раза) 0,5 107.-ный триэтиламин (ЭтИ) в СН,С 1промывка (1 раз) СН ОН промывка (2 раза) СНС 1 промывка (2 раза) 0,5 0,5 257.-ный ангидрид уксусной кислоты,в СН С 1 (2 мг/л смоль.) 20 18 СНСТ промывка (2 раза) 0,5 СНОН промывка (2 раза) 0,5 ФДля связывания Лсн и Глн, 113 б М избыток 1-гидроксибензотриазола (ГОБТ) включен на этой стадии. Составитель В,ВолковаЗаказ 4443/59 Тираж 348 ПодписноеВНИИЛИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 ВПроизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4ф