Способ получения пептидов или их солей

(53) М. Кл. С 07 С 103/52 А 61 К 37/02 Государственный комитет СССР но делам изобретений н открытийИностранцыБу Турессон аф Экенстам, Лейф Эрик Аурелл, Карл ИеранКлаэсон, Биргитта Гунилла Карлссон, Стиг Ингемар Густавссони Гун Анита Олаусон(Швеция) Иностранная фирмаАКТИЕБОЛАГЕТ КАВИ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙИзобретение относится к способуполучения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в биохимии и медицине,В химии пептидон широко используют метод постепенного наращиваь.:я пе-.тндной цепи путем конденсации активированных аминокислот,например, способом активированныхэфирон 1. Цель изобретения - синтез новыхпептидов, содержащих хромогеннуюгруппу и обладающих биологическойактивностью,Это достигается согласно описываемому способу получения пептидовобщей формулы 1.Р-А 1-А -А -ИНВ,где А - аланил-, валил-, лейцил",пропил-, пипеколйноваякислота;А - аланил- валил- глицил-,йлейцил-, изолвйцил-, фенилаланил-, азвтидинкарбо"новая кислота;А -" аргинил, лиэил;В - нитрофенил,или их солей,заключающемуся н том, что соеди-нения общей ФормулыЫ - Н,гдв В имеет указанные значения,подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далеетребуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетанияостальных аминокислот, причем Риспользуют н качестве защитнойгруппы для С-концевого карбоксилапервой аминокислоты.Реакцию сочетания двух аминокислот или депиптида и аминокислоты1 ф проводят после активирования с(,"карбоксильной группы. Активированноепроизводное может представлять собой, например, паранитрофенил, трихлорфенил, пвнтахлорфенил, М-оксисукцинимид или Б-оксибензотриазоловый эфир, симметричный или асимметричный ангидрид или азид кислоты. Синтез пептида состоит в ступенчатом добавлении аминокислот к С-концевой аргинильной или лизильной группе, снабженной хромофорной группой, действующей затем как ф группа, защищающая карбоксил.60 65 Для защиты с 6-аминогрупп применяют карбобензокси или трет,-бутилоксикарбонил или такие родственные им группы, как, например, параметокси, паранитро- или параметокси.фенилаэокарбобенэокси.Для защиты д -гуанидиновой функции аргинильной группы используютпротониэацию группы НОили пара"толуолсульфонил; Я -амйногруппы влизине защищают карбобензокси-,трет,-бутилоксикарбонил- или паратолуолсульфонильной группой;Ы;карбоксигруппу защищают метиловый,этиловый или бензиловый эфир.В описании использованы следующие сокращения:Аминокислоты (в левовращающейформе кроме особо отмеченных случаев): Рл.г - аргинин; Л,эо - 2-аэе,тидинкарбоновая кислота; Ала " ала"нин;- Гли - глицин; Иле - изолейцин;Лей - лейцин; Лиз - лизин; Фе - феНилаланин; Пип - пипеколиновая кислота," Про - пролин; Вал - валин;АцОН - уксусная кислота; Бэ - бенЗоил; КБо - карбобЕнзокси; ДЦКИдициклогексплкарбодиимид; ДМФ -диметилформамиду ТЭА - триэтиламин;ЭА " зтилацетат; ГФХ - хроматография с фильтрованием через гель;ОБТ - И-оксибензотриазолу ОсуФ 1-оксисукцинимид,; МеОН - метанолуПНФ - паранитрофеноксиу ПНА - паранитроанилиду ТБК - трет,-бутилоксикарбонил; ТФУК - трифторуксусная кислота; ТСХ - хроматографияв тонком слое.Типы реакций, применяемых длясинтеза,Для синтеза пептидов (см. таблицу, Р ХХу - Х(.П 1) разные стадии про.водят одинаковым способом поэтомудано абще описание реакцйй разныхтипов и в таблице указаны промежуточные и в ;онечные продукты, методы,применен:ье для реакций разных типов, и некоторые физические данные.Ре,у,ц .я типа 1, Сочетание хромофорной гчппы (П),20 ммолей Ы И-защищенного аргинина или я"-, Ыщ-защищенного орнитина или лизина или соответствующим образом замещенноГО производного пептида измельчают, тщательновысушиваю" и растворяют в 50 млсвежеперегнанной Б,Ю,Н,М ,Б",И"-гексаметилфосфорной кислоты при комнатной темпертгуре. Затем при перемешивании в отсутствии влаги добавляют20 ммолей триэтиламина и 30 ммолейамина, соцержащего хрбмофорную группу в виде его изоцианатного проиэвоцного, Смесь выдерживают сутки,реакционный раствор вливают в 0,5 л2-ного раствора бикарбоната натрияпри перемешивании, Образовавшийсяосадок отфильтровывают и тщательно 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промывают раствором бикарбоната,водой, 0,5 н. соляной кислотой иснова водой. Из осадка продукт извлекают метанолом, Метанольныйэкстракт упаривают, остаток перекристаллизовывают или чистят спомощью хроматографии в тонкомслое.Реакция типа 2. Отщепление карбобензокси защитной группы (КБО) .10 ммолей тщательно высушенногопроизводного карбобензокси (КВО)суспендируют в 25 мл уксусной кислоты и при комнатной температуре вотсутствии влаги добавляют 15 мл5,6 н,раствора НВг в уксусной кислоте. Через 45-60 мин реакционныйраствор по каплям и при энергичном перемешивании вливают в 800 мл безводного эфира. Выпавший осадок отделяют и промывают 2-3 раза эфиромпорциями по 100 мл. Полученный бромгидрат Й -деблокированного соединения сушат над таблетками гидроокиоси натрия в вакууме при 40 С в течение 3-16 ч,Реакция типа 3. Отщегление трет. --бутилоксикарбонильной защитнойгруппы (ТБК),10 ммолей тщательно высушенногоТБК - производного растворяют в200 мл 25-ного раствора трифторуксусной кислоты в СН С 8 в отсутствии влаги при комнатной температуре. Спустя 20 мин раствор по каплям вливают в 500 мл безводного эфи ра. Выпавший осадок отфильтровываЮти тщательно промывают эфиром. Полученный трифторацетат И -.деблоки"рованного соединения сушат над таб летками гидроокиси натрия з вакуумепри 30 С 2"3 ч.Реакция типа 4,Деблокирование А --аминогруппы.При ацилировании производногополученного при реакции ттпа 2 илидолжна, присутствовать свободнаяЫ-аминогруппа,. Деблокирование этойгруппы осуществляют разными путями,например добавляют один эквивалент.безвоцного третичного амина (тризтиламина или 1 У-этилморфолина) краствору производного НВг- илитрифторуксусной кислоты в диметилформамиде, охлажденному до -10 С,При применении триэтиламина и НВгпроиэводных,выпавший в осадок триэтиламин,гидробромид удаляют фильтрованием. оПроизводные с НВг - илн трифторуксусной кислотой можно также растворить в растворе бикарбоната натрия,иэ которого выделяемое производноеэкстрагируют, например этилацетатом, а затем органическую фазу сушат и упаривают, 700060Реакция сочетания:А. С производным И-защищенногоэфираК раствору 10 ммолей производного пептида или аминокислоты, выделенного в 20-50 мл свежеперегнан"ного диметилформамида, добавляют11 ммолей И -защищенного паранитрофенил- или Б-оксисукцинимидоэфир"производного аминокислоты при -10 С,оСмесь выдерживают 1 ч при -10 С,затем добавляют к ней в качествебуфера 5 ммолей третичного амина,Охлаждение убирают, температурареакционной массы самопроизвольноповышается до комнатной. За ходомреакции наблюдают с помощью ТСХ.В случае необходимости реакцион"ную массу охлаждают вновь и добавляют 5 ммолей основания. По окончании реакции раствор упаривают припониженном давлении, полученныймаслообразный остаток смешивают сдвумя порциями воды и чистят перекристаллизацией или гельфильтрацией. При хроматографии Фильтрованием через гель, примененной дляочистки продукта, объем элюентаполностью или частично совпадаетс объемом производного активногоэфира сочетаемой аминокислоты. Поокончании реакции (перед выпариванием) неизрасходованное производное активного эфира заменяют втечение 30 мин при комнатной температуре избытком (3-5 ммолей) первичного амина, например бутиламина.Б. С М -защищенной аминокислотой или пептидом. Образование активного эфира по ходу реакции.К раствору 10 ммолей указанногопроизводного пептида или аминокислотыв 20-50 мл свежеперегнанного диметилформамида, 11 ммолейй -защиАщенной аминокислоты или соответстгую 11 им образом защищенного производного пептида со свободной С-концевой карбоксильной группой добавляют 11 ммолей К-оксибензотриазолаили й -оксисукцинимида при -10 С.В течение 1-3 ч температуру реакционного раствора (-10 С) повьюшают до комнатной. За ходом реакции следят с помощью хроматографиив тонком слое, По окончании реакциираствор вливают при перемешиваниив 100-300 мл 5-ного водного раст"вора бикарбоната натрия,Полученный осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем чистят методом гель-Фильтрации или перекристаллизацией. Реакция типа 5. Отщепление всехзащитных групп, очистка и ионныйобмен.0,2 - 1,0 ммоль защищенного производного пептида с хромофорной группой деблокируют обработкой 5"20 млбезводного Н 1. в присутствии 0,21,0 мл анизола в аппарате Сакакибарав течение 60 мин при 0 С. Послеокончания реакции и отгонки всегоНР; сырой продукт растворяют в 33 ном водном растворе уксусной кисло"ты и раствор чистят с помощьюгель-фильтрации. Продукт сушат лиоФилизацией, затем подвергают ионному обмену в колонке, содержащейслабо основную ионообменную смолу.Сефадекс (Я) 9 АЕ - 25 в виде хлорида выдерживают до набухания в смеси метанола и воды (95;5), Для растворения и элюирования используют эту 20 же смесь. Чистый продукт сушат притемпературе ниже 0 С и пониженномдавлении, Полученный продукт растворяют в метаноле и раствор вносят вколонку подходящего размера (объем0,5 - 7,5 л, длина 100 см), заполненную сефадексом (К) Н - 20, набухшем в метаноле. Для элюированияиспользуют этот же растворитель.Элюат разделяют на фракции подходя щих объемов и непрерывно определяютих УФ-абсорбцию (254 нм.). Фракции,содержащие продукт, проверяют начистоту методом ТСХ, чистые фракции объединяют и упаривают.Производные пептида, полученныепосле удаления защитных групп с помощью НГ (аналогично реакции типа 5),в виде 30-ного раствора в воднойуксуснойкислоте вносят в колонку(объем 0,5 - 2,0 л, длина 30 см),заполненную сефадекдом (В) О -15,набухшим предварительно в воднойуксусной кислоте, продукт элюируюттем же растворителем. Фракции, со. держащие продукт (контроль УФабсорбция при 254 нм), объединяют,концентрируют в вакууме на ротор"ном испарителе при 25 СС, затемсушат при температуре ниже 0 С.Хроматография в тонком слое.Стеклянные пластинки покрываюттонким слоем кизельгеля Г (Мерк).Для проявлечия используют следующиесистемы растворителей (объемноесоотношение): А - бутанол-уксусная 55 кислота - вода (3:2:1); Р - хлороформ - метанол (9:1) 1 Р 1)а" хлороформ-метанол (19:1).По окончании хроматографии пластинку исследуют в УФ-свете (254 нм)и обрызгивают реактивом - хлорортотолуидином.14Ф 1 Нх и б еХа 1 Х Х111х х1 О ИИ Ом 10 Рй Д4 ц ОХох щц окх хх д6 х Х1 лЕ Р) фХ 1 ХМИ Н 1 о .оние 3 3 сР сР ьСЧ СЧ с СЧ (4