Способ получения гликозидных антибиотиков ввм-2478а и ввм 2478 в антибиотического комплекса ввм-2478

ОЮДСМаРЕСПУБЛИК 0% (1 12 Р 19/46,12 Р 19/ 12 К 1:0 фрг: П ИЗОБРЕТЕН 4 1 БВ%Лй .ГПАТЕНТУ в ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ ВВМА и ВВМВ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ВВМ. (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Способ заключаетсятом, что неидентифицированный аспорогенный штамм актиномицета907- 21 АТСС 39417 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей необходмые питательные компоненты, в условиях аэрации и перемешивания. при 27-32 С в течение 6-10 сут. Полученную культуральную жидкость разделяют на мицелий и культуральнййбульон, мицелий экстрагируют метанолом, а культуральный бульон бутанолом. Экстракты объединяют и очищают хроматографически с получениемнеочищенного комплекса ВВМ.Затем повторно хроматографируют,элюируют смесью, хромофюрма и метанола при возрастании концентрациипоследнего в смеси от 5 до 10%,Фракции, полученные при элюации сиспользованием 5% метанола, содержатантибиотик ВВМВ, а фракции,элюированные при концентрации метанола 10% - антибиотик ВВМ"2478 А.Антибиотики проявляют антибактериальную активность в отношении аэробных грамположительных и анаэробныхбактерий. Кроме того, антибиотикВВМА проявляет и противоопухолевую активность. 1 табл,Изобретение относится к микробиологической прамьгшленности и касается получения новых гликоэидныхантибиотиков, проявляющих антнбактериальную активность в отношенииазробных грамположительных и анаэроб.ных бактерий, а также противоопухолевую активность,Для осуществления способа используют штамм ь 907-21 " неиденти"фицированный аспорогенный актиномицет.Культурально-морфологиче ские приз"наки. Штамм Г 907-21 образует длин-,ньгй хорошо разветвленный вегетативный мицелий шириной 0,4 мкм, каторый не разделяется на полочки или, коккоидные клетки. На некоторыхагаровых средах иногда образует рудиментарный короткий воздушный мицелий, но реальный воздушнйй мицелнйне образует ни на одной нз описываемых сред. Образующие споры тела иопоры не обнаружены,Клеточная оболочка содержит мезодиаминопимелинавую кислоту, а гидролизат клетки - мадурозу, что позволяет отнести штамм к типу 111 в клеточ"ных оболочек,сутствует, растворимый пигмент отсутствует.Агар Беннета " рост умеренный,ЗО Суб стратный мицелий от темно-сероватого, желтого (91) до темно-оливкового, коричневого (96).Воздушныймицелий отсутствует или очень скудный, если образуется - рудиментарныйжелтовато-белый (92), растворимыйпигмент ярко-желтый (85),Агар, содержащий пентон, экстрактдрожжжей, железо (1 ЯР В 16), " ростумеренный. СубсФратный мицелий отсве тло-оливкового, коричневого (94)до ярко-желтоватого, коричневого(75), Воздушный мицелий отсутствует.Растворимый пигмент блестящий оранжено-желтый (67) .Агар ЮЛА - рост обильный. Субстратный мицелий от ярко-густого красного (14) до чернавато-красного (21).Воздушный мицелнй отсутствует. Ра"створимый пигмент темно-красный (16).50Агар с кукурузной мукой - ростобильный. Субстратный мицелий от ярко-желтаватого коричневого (75) дотемно-желтоватого коричневого (78).Воздушный мицелий отсутствует. Раст 55воримый пигмент густой коричневый (55).Агар С- рост слабый. Субстратный мицелий светло-желтовагый, корич"невый (75), Воздушный мицелий отсут" Бульон, содержащий трггптан и экстракт дрожжей 1 БР У 1), - рост слабый, флаккоза, бледно-желтые шарики.Диффундирующий ггигмент отсутствует.Агар Чапека - рост отсутствует,субстратный мицелий от желтоватобелого (92) до светло-оливкового,коричневого (94), Воздушный мицелийотсутствует, растворнмьгй пигмент отсутствует. Окраска и число в скобкахсоответствует стандарту окраски пошкале цветов.Агар с глюкозой и апспарагнном -. рост слабый, Субстратный мицелий отФелтовато-белого (92) до умереннооливкового,коричневого (95), Воздушный мицелий отсутствует, растворюый пигмент отсутствует.Агар с неорганическими солями икрахмалом (ХЯР В 4) - рост слабый.Субстратнцй иицелий сероватый, желтоватый, коричневый (80), Воздушныймицелий отсутствует или очень скудныйв если образуется рудиментарньгйжелтовато-белый (92), расгворимый1 гигмент темно-сероватый;.елтоватый,коричневьгй (81),Гирозиновый агар (ХБР Р 7) - ростумеренный. Субстратный мицелий от серовата-желтого (90) до ярко-желто" ватага, коричневого (75). Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует.Питательный агар - рост слабый. Субстратный мицелий от ярко-желтого (85) до темно-оливкового, коричневого (96). Воздушный мицелий отсутсг вует, растворимый пигмент отсутствует.Агар, содержащий экстракт дрожжей н экстракт солода (1 ЯР У 2), " рост умеренный. Субстратный мицелий от желто-сероватого, желтого (91) до темно-оливкового коричневого (96). Воздушный мицелий отсутствует или очень скудньй, если обраэуетсярудиментарный, светло-сероватый, желтоватый, коричневый (79), растворы гый пигмент темно-желтоватый, коричневый (78).Агар с овсяной мукой (1 ВР 9 3)- рост умеренный. Субстратный мицелий от желтовато-белого (92) до серовато- желтого (90). Воздушный мицелий о 1з142ствует нли очень скудный, если образуется - рудиментарный, белый (263),Растворимый пигмент отсутствует,Агар из картофеля и моркови - ростот слабого до умеренного. Субстратныймицелий от серовато-желтого (90) дотемно-желтоватого, коричневого (78).Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент темно-желтовато-розовый (30)Колония на среде 18 Р В 2 - ростхороший, значительно разбухшая и многослойная, диаметр 3-5 мм, поверхность имеет красновато-черную окраску, воздушный мицелий не образуется совсем или образуется рудиментарный воздушный мицелий.Данные о культуральных признакахополучены после инкубации при 28 С втечение 3 недель.Физиолого-.биохимические свойства.Максимум роста при 28 и 37 С. Нерастет при 7 и 45 С. Диапазон температуры роста 15-43 С. Рост при рН 5,011,0. Отсутствует рост при рН 4,5.Желатин разжижае т. Крахмал гидролизует. Снятое молоко не коагулирует,полностью пептонизирует. Иелаиоидные "пигменты не образует. Реакция тирозиназы отрицательная. Нитраты в нитриты не восстанавливает. Чувствитель.ность к НаС 1 растет при 4 Х ЯаС 1 и ниже, не растет при 53 йаС 1.Чувствителен к лизоциму. Рост отсутствует при 0,0012 лизоцима,Утилизация углеводов, Утилиэирует глицерин, Й(-)-арабинозу, 1(+)-арабинозу, Й-ксилозу, Й-рибозу, оС -раминозу, Й-глюкозу, Й-галактозу, Й- фруктозу, й-маннозу, й-маннит, салицин, целлобиозу, трегалозу, не утилизирует 1(-)-сорбозу, сахарозу, лактозу, мелионозу, раффинозу, д(+)-мелеэитозу, целлюлозу, дульцит, инозит, д-сорбит.П р и м е р 1. Хорошо растущую на скошенном агаре культуру штамма :907-21 используют для прививки вегетативной среды, содержащей ЗХ растворимого крахмала, 1 Х бакто-печени, 0,5 Х рыбной муки, 0,37 КаС 1, 0,1 Х (ЯН 4)804 и 0,67 СаСОЭ РН 7,0 перед стерилизацией среды. Вегетативнуюосреду инкубируют при 28 С в течение .72 ч на роторном вибраторе (250 об/мин), и 5 мл среды с культурой переносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл ферментационной 30014среды указанного состава, Ферментацвоосуществляют на роторном внбраторефпри 28 С в течение 7-10 дней, контролируя антибиотическую активность спомощью тест-культуры И 1 сгососсцз1 цсеоз РСТ 1001. Максимальная антибиотическая продуктивность 150 мкг/млна 6-7 сутки ферментации.10 П р и и е р 2. Из 20 л культуральной жидкости (рН 6,8) отделяютлепешку мицелия центрифугированием.Лепешку мнцелия экстрагируют 3 разапорциями по 5 мл метанола. Иетаноло 15 вые экстракты фильтруют, соединяюти концентрируют под вакуумом до водного раствора.Супернатант, полученный после от-.деления мицелия, экстрагируют 20 л2 п н-бутанола, и экстракт упаривают подвакуумом до водного раствора.Два водных концентрата объединяюти пропускают. через колонку ДиаинонГЦ, элюируют последовательно 5 л25 воды, 5 л 503-ного водного раствораметанола и 8 л 807-ного водного раствора метанола,Фракции, содержащие антибиотическнй комплекс ВВМ, определяют сЗ 0 помощью метода дисков и тест"культуры Вас 111 цз зиЬ 11 дз И 45 (Кес.).Активные фракции, эаоированиые807.-ным водным раствором метанола,собирают, выпаривают при пониженном35давлении и сушат вымораживанием. Получают 4,5 г желтого твердого вещества - неочищенный комплекс ВВИ.Полученное вещество пропускают через колонку из силикагеля (3,5 хх 55 см), предварительно промытуюхлороформом, и активный агенг элоируют смесью хлороформ - метанол спостепенным увеличением концентрации метанола от 5 до 10 об.Х. Пер вую активную фракцию, элюированную4557-ным раствором метанола, собирают,концентрируют под вакуумом и лиофилизируют. Получают 72 мг ВВМ 2478 В.50Вторую активную фракцво, элюированную 107-ным раствором метанола,обрабачъвают аналогичным способом.Получают 2,51 г полуочищенного твердого вещества ВВИВ, Зто веще 55ство подвергают последующей .хроматографии на силикагеле с использованиемжидкостной хроматографии среднегодавления. Злоируют смесь хлороформ:метанол (97:3 об/об), получают ак5 1423001 6 тинные фракции, которые концентри" тически не растворяется в других ор-. руют. под вакуумом. Получают одно- ганических расгворителях. Раствори- родное твердое вещество - 1,3 г мость ВВМВ аналогична раствори- ВВМА, кристаллизуют его из ме- мости А-компонента, но не растворяЧ ганола и получают желтовато-оранже- ется в подкисленной воде.вые иглы моногидрата ВВИА.физико-хнмические свойства анти- Антибиотики дают положительные биотиков. Антибиотики ВВИА и В - реакции на хлорнд железа (111) и антжелтовато-оранжевые кристаллические 10 роновые реагенчъ. Реакции Толлера и твердые вещества. ВВМА легко Сакагучи отрицательные.растворяется в диметипсульфоксиде, ВВИА дает положительную реднметилформамиде, диоксане и подкис- акцию на нингидрин, В-компонент - огленной воде, слабо растворяегся в рнцательную.метаноле,зтаноле и хлороформе, прак Тонкослойная хроматография, К,Бх 0СНС 1 -МеОН (7:3)0,37О",78 ЯхОЕсоАС-МеОН (1;1)0,160,57 ВВМАВВМВВМА ВВМ8 В, ВнешнийвидСостояние, Аморфныйпорошок Темпе- ратура плавлеияр С 225-2 71 жени Струк тури аВВИВ: а антибиотик4 дин) УФеОН нммакс41 фЕ 1 см ) 8 236(590)266(550) 333(100) 378(132) 398(205) 422(225) 236(740) 266(700) 333(118) 378(169) 398(255) 422(290) Найде но, Х Биологические свойства (антибакОтериальная активность) антибиотиковВВИА и В представлены в таб 58,285,402,06 ИРассчитано, ХС 59,01 Н 5,55 Я 2,09 Структурная ВВМА; оНт Оо 63,164,48 Антибио знач нвность ость лефоцтик ВВИА тительной протнвоо ю. Протнвоопухоле определяют на мяш итной лейкемии Р акже облапухолевойвую акзх про388, лшг 5дае акт но тикВид микро ная ингибирующИК), мкг 1 м Миним рация ая коицентзм 78 В ВВМВ арЬу 1 ососсцв ацгец9 р СарЬСмита соссцв ацгец,3 цЪгд 1 дв ас 111 ц СТ 219 1 сгосо СТ 100 сцв 1 цсец О,1 сгососсцв Г 1 ачцв 1 а со 11 всЬе 1 еЬвде чае РЬ а рпе 100 0 вецдошопав аегц 8 дова 915 10 100 агк 1 Ыа а 1 Ьь.с АМ 4888 0 гурсососсцв пеоапв Д 49 7 1 фоидной лейкемии 1 1210 и меланотической меланомы В 16,Формула изобре тения Способ получения гликозидных антибиотиков ВВМА и ВВМВ антибиотического комплекса ВВМобщей формулы Н С ВК - водород (антибиотик ВВМ247 8 В),423001 8(антибиотик ВВМА),заключающийся в том, что штамм не-,идентифицированного аспорогенногоактиномицета Г 907-21 АТСС 39417 культивируют в жидкой питательной среде,содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинныхаэробных условиях при 27-32 С, затем10 разделяют культуральный бульон и мицелий, мицелий экстрагируют метанолом, а культуральный бульон " бутанолом, полученные экстракты, содержащие антибиотический комплекс, объе 15 диняют и подвергают хроматографичес.сой очистке, далее полученный целевой продукт пропускают через хроматографическую колонку, элюируютсмесью хлороформа и метанола при воз 20 растающей концентрации последнегоот 5 до 107, и выделяют антибиотикВВМВ при содержании метанола вэлюирующей смеси 5 Х, а антибиотикВВМА - при 10%.1423001 10Продолжение таблицы Минимальная ингибирующая концентрация (МИК), мкг 1 ил Вид иикроорганизиа 1 ВВМА ВВМВ Аврег 8111 цв Еиащаецв.ХАИ 2530 100 100 ТгхсЬорЬусоп щепа 8- горЬуйев Д 155 100 ВасйегоЫев Хга 8 х 1 в С 1 овйгЫхцш йхХЯсх 1 е С 1 овйгЫ 3.цш регхапеепв РгорхопоЬасйегхщв аспев 5 ОСоставитель Г,СиирноваРЕдактор И. Горная Техред Л. Сердюкова Корректор Л,Пилипенко Заказ 4444/59 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауиская наб., д. 4/5