Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ

ОЮЗ ССВЕТСНИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ РЕСПУБЛИ 19) 504 С 01 МЗЗ 12д АНИЕ ИЗОБРЕТЕ К АВТОР(54) СПОСОБ НИКОТИНАМИД РЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОС ДЕГИДРОГЕНАЗ ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ МУ СВИДЕТЕЛЬС(46) 07.09.86. Бюл. 9 3 енинградскии орденаого Знамени медицинс(57) Изобретение относится к способам определения активности ферментов. Цель изобретения - определениеактивности никотинамидных дегидрогеназ в гетерогенных системах путемпотенциометрической регистрации изменения концентрации протонов в реакционной смеси. Регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени. Добавляют стандартное количествокислоты в случае защелачивания средыили щелочи - в случае закислениясреды. Активность дегидрогеназы определяют, сравнивая сцвиги рН в ходереакции и при добавлении кислоты илищелочи. 1 ил., 3 табл.1255934 2рН-метра, выходной сигнал которогопоступает на самопишущий потенциометр, Оптимальный диапазон параметров рН-метра и самопишущего потенциометра должен обеспечивать отклонение пера самописца на 5-15 мм приизменении рН реакционной смеси на0,01.Потенциометрическая установка,10 используемая для определения скорости окислительно-восстановительныхпревращений никотинамидных нуклеотидов, состоит из термостатированнойкюветы с магнитной мешалкой, рН-мет 15 ра со стеклянным электродом и электродом сравнения в качестве датчика,подключенного к рН-метру,. а такжесамопишущего потенциометра для непрерывной регистрации сдвига рН,20 наблюдаемого в ходе реакции, на величину 0,02-0,2 ед. рН. Начальноезначение рН, при котором проводятреакцию, сожет варьировать в пределах 4,0-10,0. Общий объем реакционной смеси также может варьироватьв пределах 2,5-15 мл и более, варьирование объема реакционной смеси производят, изменяя количество 9%-ногохлорида натрия.30 Концентрацию буфера в реакцион-ных смесях можно варьировать в пределах 0-0,05 М в зависимости оттребуемой чувствительности определения, Концентрации субстратов и никотинамидных коферментов могут бытьлюбыми, но не менее 0,5"10-61 10 М, При использовании предлагаемого способа для определенияактивности дегидрогеназ концентра 40 ции субстратов и коферментов должнысоответствовать оптимальным значениям. т;е, находиться в диапазоне0,1 10-100 10" М для субстратов Чувствительность предлагаемого способа регистрации скорости реакций зависит от чувствительности рН реакционной смеси и высвобождения или поглощения протонов в ходе исследуемой реакции и связана с величиной буферной емкости реакционной смеси, которую предлагаемый способ позволяет варьировать в широких пределах. Для регистрации скорости окислитель- но-восстановительных превращений никотинамидных нуклеотидов достаточно обеспечить такую буферную емкость реакционной смеси, при которой сдвиг рН на 0,1 ед, происходил бы под влиянием добавления в реакционную смесь 0,05-0,1 мкмоль соляной кислоты или гидроокиси натрия, что эквивалентно высвобождению или поглощению из среды такого же количества протонов. Непрерывную регистрацию измерения рН производят при помощи 0 Изобретение относится к физической биохимии, а именно к способамопределения активности ферментов.Цель изобретения - определениеактивности никотинамидных дегидрогеназ в гетерогенных системах засчет потенциометрической регистрацииизменения концентрации протонов вреакционной смеси.Способ осуществляется слецующимобразом,Проводят регистрацию динамики рНв ходе реакций окисления восстановления никотинамицных коферментов.сопровождающихся изменением концентрации протонов в реакционных смесяхв соответствии с уравнением-2 е -2 Н При этом используют реакционнуюсмесь, в которой изменение рН в ходереакции пропорционально количествупротонов, выделяемых в реакционнуюсмесь или поглощаемых из нееПриэтом скорость процесса, как и поспектрофотометрнческсму способу,оценивается по скорости окисленияНАД(Ф)Н (или восстановления НАД(Ф)+ )Скорость изменения концентрацииНАД(Ф)Н или НАД(Ф) регистрируют поизменению рН реакционной смеси, имеющей калиброванную буферную емкость.и 0,1 10- - 2 10- для коферментов. П р и м е р 1. Лактатдегидрогеназная реакция освобождение протонов в среду (если реакция протекает в прямом направлении) или захват их из среды (если реакция протекает в обратном направлении) определяется уравнениемМолочная кислота + НАД пировиноградная кислота + НАДН + Н В соответствии с этим уравнениемв прямой реакции можно наблюдатьвосстановление НАД и высвобождениев среду эквимолярного количествапротонов. В обратной реакции проис1255 3ходит окисление НАДН и захват изсреды протонов в состав молекулымолочной кислоты. Равновесие этойреакции резко сдвинуто в сторонуокисления НАЦН, т.е. в сторону обра-зования молочной кислоты. Поэтомудля определения активности лактатдегидрогеназы предпочтительнее поль- зоваться реакционной смесью, содержащей исходно пируват и НАДН, а не Олактат и НАД1Реакционная смесь имеет сос-,тав, приведенный в табл. 1.Потенциометрический анализ реакционной смеси проводят в следующем 5порядке:1. В термостатированную при 37 Скювету объемом 4,0 мл приливают дистиллированную воду и промывают находящиеся в кювете электроды, включая 20магнитную мешалку. После промыванияэлектродов воду удаляют.2Вносят в кювету реакционнуюсмесь (компонент 1 - 4, табл. 1)и погружают электродную пару так, 25чтобы не было препятствий перемешиванию содержимого кюветы магнитноймешалкой.3. Производят запись изменениярН в реакционной смеси при помощи ЗОсогласованного с рН-метром самопишущего потенциометра,На чертеже приведена кривая изменения рН при лактатдегидрогеназнойреакции окисления НАДН, где дмомент начала регистрации рН в реакционной смеси, состоящей из компонент 1-4 (табл. 1);- внесениев реакционную смесь компонента 5;-2 - калибровка буферной емкости 40реакционной смеси 0,01 мкмоль(0,02 мл) соляной кислоты; л - сдвигпера самопишущего потенциометра,обусловленный защелачиванием реакционной смеси за счет накопления 45продуктов реакции, взятый в пересчете на десятиминутный интервал времени, мм/мин; Н - сдвиг пера самопишущего потенциометра послебыстрого внесения 0,01 мкмоль соляной кислоты; 1 - время.Начальная скорость изменения рНсоответствует участку а - о4. Приливают компоненту 5, "запускающий" регистрируемую ферментативную реакцию (для лактатдегидрогеназной реакции это - раствор пирувата) и производят запись измене 934 4ния РН эа счет специфического окисления НАДН. Для этого достаточно 5-10 мин (участок о - о ).5. Казуибруют реакционную смесь, добавляя 0,02-0,1 мкмоль НС 1 в 0,05-0,2 мл (скачок рН вследствие добавления кислоты обозначен моментом 1 - участок 1 - 2 ).6. После записи реакции и проведения калибровки реакционную смесь удаляют, кювету и электродную пару трехкратно промывают водой по и. 1,Вычисление скорости окисления НАДН проводят, используя данные, полученные при записи потенциометрической кривой.Скорость ферментативного окисления НАД вычисляют по формулеЪ = - - х - х 60 = 0,06 Ь/Н 001 Ь Н 10где Ъ - активность фермента в пробе, мкмоль/ч;Ь - сдвиг пера самописца за счетспецифического изменения рНв ходе ферментативной реакцииза 10 мин, мм.Определение активности лактатдегидрогеназы в холе окисления НАДН потенциометрическим способом в образце фермента дает результат, соответствующий спектрофотометрическому определению активности. Активность лактатдегидрогеназы. выявленная потенциометрическим способом, составляет 4,45 ф 0,48 мкмоль/чемл, по спектрофотометрическому способу 4,7 ф 0,62 мкмоль/ч мл.П р и м е р 2Определение активности алкогольдегидрогеназы потенциометрическим способом можно осуществить, пользуясь реакционной смесью состава, представленного в (табл. 2).Выполнение анализа проводят так же, как и в примере .В табл. 3 представлены результаты определения активности лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы.П р и м е р 3. При помощи потенциометрического способа возможно определение активности дегидрогеназ в гетерогенных системах. В качестве примера реализации способа в гетерогенных системах проведена серия определений активности лактатдегидрогенаэы в реакционной смеси,5 1255934 Ьсодержащей активированный уголь (один риментах, проведенных потенциометрииэ сорбеитов, применяемых при гемо- ческим способом, установлено снижесорбции). Данное исследование спект- ние активности лактатдегидрогеназы рофотометрическим способом провести с 4,45 ф 0.48 мкмоль/ч мл в реакционневозможно вследствие оптической ной смеси, не содержащей уголь, до непрозрачности реакционной смеси, 1,800,14 в реакционной смеси с акти- содержащей взвесь угля в условиях вированным углем в качестве адсорпос гоянного перемешиванияЗ экспе- бента (табл. 3),Т а б л и ц а 1 Компо- Объем название, концентрация инент рН вносимого компонента 2 мл 97-ного БаС 1, доведенного0,1 М ИаОН до рН 8,20 0,05 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера, рН 8,О0,2 мл 2 10М НАДН 0,55-0,05 мл препарата, содержащегонеизвестное количество лактатдегидрогеназы 0,2 мл 2 10М раствора пирувата натрия,рН 8,20Общий объем реакционной смеси доводятводой до 3 мл Таблица 2 Компонент Объем, название, концентрация и рН вносимого компонента 2 мл 9 Е-ного ЫаС 1, доведенного 1 ММаОН до рН 8,20 0,05 мл 00514 М трис-НС 1 буфера,рН 8,20 0,2 мл 0,01 М НАД 0,055-.0,05 мл препарата, содержащегонеизвестное количестве алкогольдегигдрогеназы 0,2 мл 0,02 М раствора этанола,рОбщий объем реакционной смеси доводятводой до 3 мл1255934 Таблица 3 Активность фермента, мкмоль/ч мл Раствор НАДН 0 7 фО 12 Раствор НАД+ и = 6 12, 2+0,81 и = 12 Раствор НАДН Плазма крови человека, содержащаялактатдегидрогеназу . 4 Взвесь 100 мг активированногоугля, приготовленная на растворе хлористого натрия трис НС 1-буфер, рн 8,0 1,80+ 0,14 Раствор НАДН 1,42+0,12 Раствор НАД и = 4 Раствор алкогольдегидрогеназы Раствор этанола кубации фермента в реакционной смеси,содержащей буфер, субстрат-акцепторили донор электронов и никотинамидный кофермент, о т л и ч а ю щ и йСостав реакционной смеси.1 Раствор хлористого натрия трис-НС 1 буфер рН 8,0 Раствор лактатдегидрогеназы Раствор пирувата натрия 2 Раствор хлористого натрия трис-НС 1 буфер, рН 8,0 Раствор лактатдегидрогеназыРаствор молочной кислоты 3 Раствор хлористого натрия трис-НС 1 буфер, рН 8,0 Раствор пирувата натрия Раствор лактатдегидрогеназы Раствор пирувата натрия 5 Раствор хлористого натрия трис-НС 1 буфер, рН 8,0 формула из обре те ния Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ путем ин 4,45+0,48и " 610 1255934 оставитель Н. Гуляеваехред Л.Сердюкова Корректо лб Рогули а з 4816/44 аж 77 Подписное осуцарственного комитета СССРам изобретений и открытийква, Ж, Раушская наб., д. ВНИИПО по д 113035, Мводственно-полиграфическое предприятие, г. П д, ул. Проектная,с я тем, что, с целью определения в гетерогенных системах, регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени, затем добавляют стандартное количество кислоты в случае защелачивания среды или щелочи - в случае закисления среды, а активностьдегидрогеназы определяют, сравниваясдвиги рН в ходе реакции и при добавлении кислоты или щелочи.