Способ выделения пропердина из сыворотки крови

98 СООЗ СОВ СОЦИАЛИ РЕСПУБЛ СНИ ГОСУДАРСТОЕННПО ДЕЛАМ И ЫЙ НОМИ СССРРЫтий ОПис НИЕ. ИЗОБРЕ(54) (57) СПОС(Ж ВЫЖЛЕНИЯ ИЗ СИВОРОТКИ КРОВИ, включ цнФическую адсорбцию его н элюцию с эимоэана, Фракцио нронердина на ДЭАЭ-целлюло его, о т л и ч а ю щ и Ф с с целью получения более о концентрироэанного, актнвн иммуиогепного аронердина и крови рунного рогатого ск упрощенна очистки, Фракцио пропердина. на ДЭАЭ-целлюло ществляют в присутствии 0 Ма-К-ФосФатного буФера рй а элюцню с ДЭАЭ-целлюлоэц градиентом 0,1.0,4 И 8 аС буФере. ающий сценмоэан,иров ание Фасо ФФ ЗЮ И АВМВФНОМУ(71) Московская ветеринарная академия им.К.И.Скрябина(56) 1. КогЬвееп Р. Боне рМвса 1апд сЬеаса 1 сЬагасйегьвйдсв оГ ргорегдхп. -Чох Запя, 1963, ч. 8, р, 113115,2. РепвЕу Л Ныв Р., Тоод Е.Ж.еХ. а 1.Ргорегдев оЕ М 8 ЬВ 1 у рцгй 1 е 6Ьавап ргорпйы. - Ю. Еанюпо 1 ояу,1968, т. 100, р. 142-158. 4(51) С 07 К 7/00 С 12 е и эаецнюя тем;чточищенногоого и9 сывороткиота инированиеэе осу 02-6,05 Н7,1-7,8,проводятв этом113701Изобретение относится к ветеринарии, а именно к получению очищенных ферментных препаратов, и может быть использовано в научно-исследо" вательских целях в иммунологии, биохимии, терапии.Известен способ выделения пропер- дина из сыворотки крови путем осаждения его с фракцией эуглобулинов и дальнейшего фракционирования на ко лонке с ДЗАЭ-целлюлозой Я .Однако данный способ непригоден для получения высокоочищенного пропердина.Наиболее близким к предлагаемому 15 является способ получения высоко- очищенного фермента, заключающийся в специфической адсорбции пропердина на зимозан-полисахарид дрожжевых клеток (5 мг/мл) при 17 С в течение 20о1 ч; элюции его из комплекса зимо" зан-пропердин буфером с высокой ион" ной силой; осаждении из элюата под" кислением до рН 5,6 Ю,1 центрифугированием при 53000 1 ч", растворе нии осадка в 1 а-фосфатном буфере рН 8,0, концентрация 0,005 М и отделении нерастворившихся белков центрифугированием при 105 0001 ч. Далее следует фракционирование про пердинсодержащей Фракции на ДЗАЗ-целлюлозе, уравновешенной Иа-Фосфатным буфером рН 8,0, концентрация 0,005 М, Активный пропердии не сорбируется на анионите, злюцию его проводят стартовым буфером. Дальнейшая очистка заключается в освобождении нропердина от примесей на колонке с катионитом КМ-сефедекс С, уравновешенным а-Фосфатным буфером рН 5,9,40 концентрация 0,0002 М. В данных условиях пропердин сорбируется на сефадексе и затем элюируется линейным градиентом ЙаС 6 (0,1-0,4 М) в стартовом буФере. Выход Фермента 45 составляет 183 121.Однако известный способ непригоден для выделения пропердина иэ сыворотки крови крупного рогатого скота, так как при фракционировании на ДЭАЭ-целлюлоэе частично очищенного препарата фермента не происходит сорбции активного пропердина и большинства примесей на ионообменнике, поэтому на выходе из колонки получают частично очищенный, сильно разбавленный пропердин. Для получения высокоочищен ного пропердина необходимы дополни" 98тельные стадии очистки, требующиеналичия дорогостоящего и труднодоступного реагента,Цель изобретения - получениеболее очищенного, концентрированного,активного и уммуногенного пропердинаиз сыворотки крови крупного рогатогоскота и упрощение очистки.Поставленная цель достигаетсятем, что фракционирование пропердинана ДЭАЭ-целлюлозе. осуществляют вприсутствии 0,02-0,05 М 8 а-К-фосфатного буфера рН 7,1-7,8, а элюцию сДЭАЭ-целлюлозы проводят градиентом0,1-0,4 М ИаС 1 в этом буфере.На фиг. 1 представлен характерныйпрофиль элюции белков, адсорбировавшихся на зимозане в первом примеревыполнения способа; на фиг. 2 - то же,во втором примере выполнения.Изменение условий разделенияэлюата с зимозана на ДЗАЭ-целлюлозеисключает необходимость предварительного фракционирования его путем подкисления до рН 5,610,1 и центрифугирования при 530001 ч и 105000ч, а также дополнительной очисткина КМ-сефадексе С. Способ выделения пропердина осуществляется следующим образом.1.,5-2,0 зимозана, предварительно прокипяченного в физиологическом растворе 11 аС 3 на водяной бане в течение 1 ч и осаженного центрифугированием при 1000-1500 об/мин на ЦЛС-З, смешивают с 300-400 мл бычьей сыворотки и инкубируют прио15-17 С 1 ч, постоянно перемешивая. Затем частицы зимозана с адсорбировавшимися на нем белками отмывают центрифугированием при 1000 об/мин на ЦЛС10-15 мин ледяным 0,0003 М веронал-мединаловым буфером рН 7,4 несколько раз общим объемом 500 мл. Отмытые частицы суспендируют в 60- 70 мл 0,002 М Ма-фосфатного буфера рН 7,3, содержащего 1 М 8 аС 1 и 0,002 М ЭДТК. Элюцию белков с зимозана проводят при 37 С в течение 15-20 мин на магнитной мешалке. Частицы зимозана отделяют центрифугированием в описанных условиях, а экстракцию повторяют снова. Элюаты соединяют и диализуют против 5 л 0,02- 0,05 М М а-К"Фосфатного буфера рН 7,1-7,8 два раза в течение суток при 4 С. После диализа проводятоконцентрацию элюатов на полиэтилен.3 1137098 4гликоле ( мол. масса 35000) до ;полиэтиленгликоле (мол.масса 35000)конечного объема 50-70 мл. Центри- .до конечного объема 50 мл (5-6 чфугированием при 4 С и 3000, об/мин при 4 С). Сконцентрированный материал,о она цЛС30 мин осаждают образовав- содержащий пропердин, центифугируютшийся осадок денатурированных белков, 5 при 3000 об/мин и 4 С на КЛС30 минНадосадок, содержащий пропердин для осаждения денатурированных бели 4-6 белков-примесей, служит мате- ков.риалом для нанесения на колонку Полученный раствор наносят на(2,258 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, урав- колонку (2,2 58 см) с ДЭАЭ-целлюлоновешенной буФером для диализа. 10 зой,.уравновешенной буфером дляМатериал наносят на колонку со ско- диалиэа. После того, как весь матеростью 30 мл/чПосле того, как весь риал войдет в колонку, начинают проматериал войдет в колонку, начинают пускать стартовый буфер для вымыванияпропускать стартовый буфер (1,5- несвязавшихся с анионитом белков.2,0 объема колонки) для вымывания 15 Выход белка контролируют измерениемнесвязавшихся с колонкой белков. . оптической плотиости раствора приЗатем элюируют связанный с ионообмен- длине волны 280 нм на Сф(спектником пропердин стартовьм буфером, рофотометр).содержащим 0,1-0,5 М ОаС. При со- После выхода первого белковогодержании в буфере 0,3 н 0,4.М йаС 2 б пика (необходимо чтобы Д равняЭ 280последовательно элюируются обе Фрак- лась нулю) начинают элюцию проперции пропердина, которые собирают в дина. Для этого через колонку пропускают около 300 мл: стартового буфе"П р и м е р 1, Берут 1,5 г пред- ра, содержащего 0,1 М Нас, приварительно измельченного в ступке д этом выходит второй белковый пик,энмоэана, кипятят в 100 мл Физиоло- состоящий из небольшого количествагического раствора КаС 1 на водяной Функционально неактивных, но с сохбанеане в течение 1 ч, отмывают 200 мл раненной антигениой структурой фрактого же раствора центрифугированием ций пропердина (идентификацию пропри 1000 об/мин, 10 мин на ЦЛС. Эб водили ввмунохнмическим методом). , 3000 мл бычьей сыворотки крови, ох- Затем пропускают последовательно лажденной до 15 С, смешивают с зимо- по 1,5-2,0 объема колонки стартовогозановым осадком и инкубируют при той , буфера, содержащего 0,3, 0,4 и 0,5 Мже температуре 1 ч, постоянно номе- МаСо .шивая. Комплекс зимозана с белками Характерный профиль элюции белковос аждают центрифугированием при 4 С адсорбироваваихся на эимозане, иза 35и 1000 об/мнн на ЦЛС. 20 мин. Час колонки с ДЭАЭ-целлюлозой представ,тицы отмывают троекратно ледяным лен на Фиг. 1.0,0003 М веронал-мединаловым буферомрй 7,4 (общим объемом 500 мл). объем собираемых фракций 6-8 мл.Элюцин белков с зимозана п ово ятследующим образом.имо на проводят Идентификацию белковых циклов проводили титрованием проперднна зимозаОсажденные частицы зимозана суспенновым методом Пиллемера. В результадируют в 60 мл нагретого до 37 ОСте хроматографии получают гомоген,002 М а-фосфатного буфера рН 7,3, ф 5 ные Формы-пронердина (около 15 мл) содержащего 1 М ЙаС 3 и 0,002 М ЭДТК и-пропердина (около 20 мл) с удель,суспензию инкубируют при 37 оС 15- ;ной активностью соответственно 6,32 20 мин, перемешивая. Вновь частицызимозана осаждают, надосадок сливаютП р и м е р 2. Условия выделенияв отдельную посуду, а экстракцию .О гропердина аналогичны примеру 1.белков повторяют. Оба надосадка сое- После того, как элюаты с зимозанадиняют вместе, помещают в диализный сконцентрированы, проводят диализмешочек, непроницаемый для белковых . против 5 л 0,035 М я а-К-фосфатногомолекул, и диализуют. против 5 л . буфера рН 7,5 два раза в течение0,02 М 1 а-К-фосфатного буфера рН 7,1 55 24 ч при 4 С на магнитной мешалке.два раза в течение 24 ч при 4 С на После этого материал концентрируютомагнитной мешалке. После этого про- на полнэтиленгликоле (мол.массаводят концентрацию материала на 35000) до конечного объема 60 мл.Сконцентрированный материал, содержа. щий проперции, центрифугируют при 4 С на ПЛС30 мин при 3000 об/мин для осаждения денатурированных бел-. ков. 5Полученный раствор наносят на колонку (2,2 58 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной буфером для ,диализа. После того, как весь мате,риал войдет в колонку, начинают про- .10 пускать стартовый буфер для вымывания несвяэавшихся с ионнообменником1 белков. Выход белка контролируют измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм на 5 приборе СФ(спектрофбтометр). После выхода первого белковбго пика (необходимо, чтобы ДВО равнялась нулю) начишают элюцию пропер- дина. Для этого через колонку пропус-И кают около 300 мл стартового буфера, содержащего 0, М МаС 1, при этом выходит второй белковый пик, состоящий из Функционально неактивных, но с сохраненной антигенной структурой 25 Форм пропердииа. Затем пропускают последовательно стартовый буфер, содержащий 0,3, 0,4 и 0,5 И йаС.Характерный профиль белков, адсор- бировавшихся на зимозане, из колонки Зо с ДЭАЭ-целлюлозой приведен на фиг. 2.Скорость тока а колонке 35 мл/ч, объем собираемых фракций 6-8 мл, Идентификацию белковых пиков проводили титрованием пронердина зимозановым методом Пиллемера. В результате хроматографии получают гомогенные фракции формы-пропердина (15-20 мл) и-проердина (20-25 мл) с удельной 4 О активностью соответственно 6,25 и 13,0 ед/мг.П р и м е р 3. Усговия адсорбции проиердина на зимозан и элюции его с зимозановых частиц аналогичны гри меру 1. Затем элюаты соединяют, помещают в диализный мешочек, непроницаемый для белковых молекул, и диализуют против 5 л 0,05 М йа-К-фосфатногд буфера рН 7,8 два раза в течение суток при 4 С на магнитной мешалке. После этого проводят концентрацию материала на полиэтиленгликоле (мол.масса 35000) до конечного объема 70 мл. Сконцентрированный материал центрифугируют при .3000 об/мин и 4 ОС на ЦЛС30 мин для осаждения денатурированных белковФракционирование частично очищенного пропердина проводят аналогично примеру 1, применяя 0,05 И Иа -К-фосфатный буфер рН 7,8. График элюции белков с ионообменника идентичен графику на фиг. 2.Скорость тока в колонке 35 мл/ч, объем собираемых Фракций 6-8 мл, идентиФикацию пропердина проводят по методу Пиллемера. В результате получают-пропердин (10-14 мл) с удельной активностью 6,25 ед/мг, (-пропердии (15-20 мл) с удельной активностью 13,0 ед/мг.В табл. 1 дается характеристика предлагаемого способа выделения пропердина, а в табл, 2 - характеристика известного способа выделения. нропердина.По известному способу пропердин не удалось выделить в значимых количествах из сыворотки крови крупного рогатого скота. При этом полученный пропердин малоактивен и содержит примеси. Таким образом, известный способ не может быть использован для получения пропердина, пригодного для приготовления специфической антисыворотки, из сыворотки крови крупного рогатого скота.Предлагаемый способ позволяет полу. чить высокоочищенные, концентрированные, активные и иммуногенные (получена антипропердиновая сыворотка) Фракции пропердина в две стадии очистки.11137098 Таблица 1 г Специ- фиче- ская Общийбелок,мг Степень очистки ВыхОд,Х мл Удельнаяактивностьед/мг Общая . активСтадии очистки ностьед активность, ед/мл 1120 О,И100 Бычья сыворотка 400 .33600 2,80 Злюция белковс зимозана 13,4 35 150 1,05 120 143 1,25 Фракционирование на ДЭАЭ- целлюлозе с Яа-К-фосфатным буфером 0,02- 0,05 М, рН 7,1-7,8 2,50 6,3275,00 6,70 11,72Специ- ОбщаяФиче- активская ность,актив-, едность,ед/мл100150 1,05 13,4 25,00 2,23 211 10 3,95 20 6,40. -пропердин-пропердин 390 3,75 Т а б л и ц а 2 Общийбелок,мг Стадия очистки Выход,Х Степень очистки Элюция белков с зииозана35 120 143 1,25 Осаждение пропердина прирН 5,6 10 8 1,70 17 2,10 . 1,5 70 Фракционированиена ДЭАЭ-целлюлозе с на-фосфатным буфером 1,00 2 3,10 0,2 103 фракцйонированиена КМ-сефадексе 2 0,42 . 1,00 2 4,800,2 160 Бычья сыворотка 400 33600 2,80 1120 0,03еева орректор Н, Корол ираз 354 10461/18 ое ,. Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектн И 30 268 ВНИИПИ Гос по .делам 113035, Москнрственного комитета СССРобретений и открытийЖ, Раушская наб., д. 4