Способ получения лейкоцитарного интерферона

,уф щ,: ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЛЬСТВ ВТОРСКОМУСВ 1исследовательной биологииТатьков,ев,ство СССР /001982. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПИ(46) 23.03.86. Бюл. В 1 (71) Всесоюзный научноский институт молекуляр (72) В.А.Петренко, С.И. Л.Н.Семенова, А.А.Ильич Г,А.Мизенко, В.В,Зорин и И.В.Тимофеев(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА, включающий трансформацию реципиентного штамма ЕзсЬег 1 с 1 па со 1 рекомбинантной ДНК,кодирующей лейкоцитарный интерферон,с последующим культивированием и выделением целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюускорения способа, в качестве рекомбинантной ДНК используют ДНК М 136 1112, а в качестве реципиентного штамма ЕзспегсЬ 1 а со 1 используют ЕзсЬег 1 сМа,со 11 2 М 103.510 с Изобретение относится к молекулярной биологии и генной инженериии может найти применение в научныхисследованиях и производстве противовирусных препаратов.Цель изобретения - ускорениеспособа,П р и м е р 1. Клетки бактерийЕ. со 1. 3 М 103 трансфицируют ДНКМ 131 112 известным хлоркальци -евым методом и инфицируют фагом М 13уЬЬ 112 обычным способом. Клетки высевают на чашки Петри с твердымагаром и отбирают колонии трансформированных бактерий, демонстрирующиеактивность 3 -галактозидазы. Колониипереносят в питательную среду и выращивают в виде суспензии обычнымспособом. Клетки после. отделенияцентрифугированием и ресуспендирования разрушают с помощью лизоцимаи ультразвука.Гибридный белок идентифицируют всоставе лизата бактерий, белковойфракции, полученной при осаждениисульфатом аммония, или солевых растворов после хроматографии по его антивирусной и ферментативной активности, обнаруживаемой в растворах,и после отделения белка с помощьюантител к интерферону, Структурабелка подтверждается также даннымипо связыванию 1253-меченых антителк интерферону препаратом белка,сорбированного на антителах к -галактозидазе.Антивирусная активность гибридного белка,Отбирают аликвоты бактериального лизата, полученного как описано в примере 1, и определяют антивирусную активность по известному способу с использованием клеток диплоидных фибробластов человека (легкие эмбриона человека), штамма ДКиз банка, культур клеток ВНИИ молекулярной биологии. Клетки инфицируют вирусом энцефаломиокардита мьппей (ЕМС).Активность интерферона и активность гибридного белка сравнивают с активностью стандартного лейкоцитарного интерферона (препарат ВНИИОЧБ, Ленинград, охарактеризованный относительно международного стандарта) В 69/19 методом ингибирования цитопатического эффекта. Определяемая таким способом продукция гибридного белка трансформированными клетками Е.со 11 15 20 2 30 35 40 45 50 3 М 103 не ниже 10 ед/л (3 10 + + 2 10 ед/л по результатам шести независимых опытов). В контрольных экспериментах с лизатами нетрансформированных бактерий или бактерий, трансформированных ДНК, не содержащей гена интерферона, антивирусная активность не обнаруживается.Обнаружение гибридного белка в колониях трансформированных бактерий. Бактериальные клетки Е.со 1 ь ЮМ 103 трансфицируют ДНК М 13 36 Ь 112или инфицируют фагом М 13 16 п 112обычным способом и высевают на чашки Петри с твердым агаром, содержащим индуктор-галактозидазыизопропилтио 3 -0-галактопиранозид(Л-Гал). Колонии трансформированныхбактерий обнаруживаются по интенсивной синей окраске;Обнаружение гибридного белка всуспензии трансформированных бактерий,В этом случае белок обнаруживаюттак же, как описано для-галактозидазы в присутствии о -нитрофенил-д-галактопиранозида (ОНФГ) похарактерному окрашиванию в желтыйцвет.Обнаружение гибридного белка влизае трансформированных бактерий.Лизаты бактерий Е.со 11 1 М 103,трансформированных ДНК М 13 36 Ь 112,получают разрушениемклеток ультразвуком после обработки лизоцимом,как описано. Аликвоту бактериального лиэата разбавляют в 2 разабуферным раствором 2 , добавляют0,2 объема 0,4 Е-ного водного раствора ОНФГ и инкубируют смесь прио28 С в течение 10 мин - 7 ч в зависимости от концентрации белка. Вконтрольном опыте используют лизатнетрансформированных бактерийЕ,со 1. У М 103. Чувствительность об.наружения химерного белка - менее10 усл.ед. антивирусной активностив 1 мл Концентрирование препарата гибридного белка и обнаружение последнего в солевых растворах после хроматографии,К 2 ч, осветленного центрифугированием клеточного лизата трансформированных бактерий Е,со 11 Э М 103 добавляют 1 ч. насыщенного раствора1219647 4 1 О 15 20 25 30 35 40 45 Техред Л.Олейник Корректор Л. Патай,Редактор В. Петраш Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 сульфата аммония и осаждают при 10 С фракцию, включающую гибридныйобелок. Содержание его во фракции, определяемое по ферментативной активности, как описано в примере 5, составляет 907 от исходного содержания в лизате.Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в буферном растворе, содержащем 0,02 моль фосфата калия рН 7,5, 1 ммоль-меркаптоэтанола и 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты, и диализуют в течение 16 чопри 4 С против 2 л этого же буферного раствора. Сохранение гибридного белка контролируют по 06 -донорной активности и специфическому связыванию с й Кантителами к интерферону. Часть раствора наносят на колонку (0,9 х 8 см) с ДЕАЭ-целлюлозой, колонку промывают раствором, содержащим 10 ммольтрис -НСХ рН 7, 6, 5 ммоль сульфата магния, 20 ммоль 5 -меркаптоэтанола (контроль - по оптической плотности фракций при 280 нм) и элюи руют колонку тем же раствором, содержащим дополнительно хлористый калий в концентрации, линейно возрастающей от 0 до 1 М) по 20 мл. Собирали фракции по 2 мл, контролируя содержание в них суммарного белка (по оптической плотности) и химерного белка. С этой целью из фракций отбирают аликвоты по 100 мкл, добавляют 200 мкл 2 -буферного раствора, 100 мкл 0,4 Е-ного раствора ОНФГ, 10 мкл раствора 6-акцептора и обнаруживают химерный белок, Основную часть клеточного белка обнаруживают в 1-5 фракциях, химерный белок - в 6-8 фракциях. Обнаружение гибридного белка в комплексе с антителами к интерферону.Моноклональные антитела МКк лейкоцитарному К -интерферону человека сорбируют на полистирольную пла,ту для иммунологических реакций известным способом. Гибридный белок сорбируют на антитела из лизатов Заказ 1234/36 Тираж 490 бактерий или солевых растворов, платутщательно (16-18 раз) ополаскиваютдистиллированной водой и обнаруживают гибридный белок по О -донорнойактивности в присутствии ОНфГ идобавленного-акцептора-галакто-зидазы из лизата бактерий Е.со 13 М 103 по характерному яркомуокрашиванию лунки в желтый цвет,Оптическую плотность растворов определяют спектрофотометрически при420 нм. Чувствительность обнаружения гибридного белка - менее100 усл.ед. антивирусной активности в 1 мл, Обнаружение гибридного белка в комплексе с антителами к / -галактозидазе,Антитела к 3 -галактозидазе (фракция иммуноглобулинов, истощенная по белкам К.со 1) сорбируют на полистирольную плату для иммунологических исследований обычным способом. Гибридный белок сорбируют на антителах при 4 С в течение 24 ч. Отмытую плаату инкубируют с мечеными 125 1 (510 имп./мин в 100 мкл) моноклональными антителами НКв течение 6 ч при о4 С. Плату ополаскивают дистиллированной водой (16 - 18 раз) и определяют радиоактивность образцов известным способом.Использование предлагаемого гибридного белка и способа его получения позволит исследовать экспрессию я регуляцию гена интерферона сс в клетке, определять внутриклеточное,содержание продукта этого гена, Исследовать структурно-функциональную организацию белка, значительно облегчить выделение антивирусного препарата из клеточных лизатов и их очистку.Полученный препарат гибридного белка используется при определении оптимальных условий получения и очистки интерферона, а также при изучении структурно-функциональнойорганизации интерферона.