Способ селективного определения биогенных порфиринов

)5 6 01 й 21/ НИЕ ИЗОБ оаоМЩ й -11" 1 Л 6 3ЬйБЛ 1":СТЕНА К АВТОРСКО СВИДЕТЕЛЬС ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(71) Институт биохимии им,А.Н.Баха, Совместный советско-вьетнамский научно-исследовательский тропический центр при Институте эволюционной морфологии и экологии животных им.А.Н.Северцова (72) Д.Б.Папковский, А.П.Савицкий, Г.В.Пономарев, С.П.Позняков и В.С.Румак (56) Авторское свидетельство СССР, Ь 1755130, кл. О 01 И 21/64, 1990.11 в С. К. Н 1 р 11-рег 1 оаапсе 11 с 1 в 1 б СЬгогпатоцгарЬу о 1 рогйгпз 1 оогпа 1 о 1 СМота 1 оцгарйу, 1988, ч.429, р 123.(54) СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ ПОРФИРИНОВ (57) Способ селективного определения биогенных порфиринов предусматривает обра.Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть испрльзовано в медицине, биотехнологии, бИохимических исследованиях.Целью изобретения является упрощенйе способа селективного определения порфиринов, ускорение и повышение чувствительности анализа при определении прото-, копра- и уропорфиринов.Поставленная цель достигается тем, что анализируемые растворы биологических жидкостей, содержащие данные порфирины или их смеси, обрабатывают солями двух валентного палладия таким образом, чтобы кОличественно перевести все содержащиеся в них порфирины и их палладиевые комботку образца и последующее определение отдельных порфиринов или групп порфири-нов по люминесценции с использованием стандартов. Образец обрабатывают раствором соли Рб (11) таким образом, чтобы полностью перевести находящиеся в нем порфирины в палладиевые комплексы, Определение ведут путем измерения фосфоресценции полученного после обработки раствора в присутствии сульфита или сульфита натрия в конечной концентрации 5-15 мг/мл при рН 6,5 - 7,5 в присутствии добавок поверхностно-активных веществ (ПАВ) и без ПАВ, после чего по результатам нескольких измерений рассчитывают концентрации определяемых порфиринов. 1 з.п.ф-лы, 1 табл,плексы, после чего определяют содержание порфиринов по фосфоресценции их Рб-комплексы в водных растворах с использованием добавок различных поверхностно активных веществ (ПАВ), СдРб-порфирины обладают способностью интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатной температуре, причем квантовые выходы фосфоресценции Рбпорфиринов (порядка 0,1 - 0,2) выше, чем квантовые выходы флуоресценции соответствующих порфиринов (соответственно порядка 0,05-0,1), Более того, длительная люминесценция Рб-порфиринов (времена свечения порядка 1 мс) и спектральные свойства оптимально подходят для их селек 1803832тивного определения в сложных биологических системах с рекордно высокой чувствительностью методом импульсной флуориметрии с миллисекундным временным разрешением. Эти соединения, в частности, нашли применение для ковалентного маркирования антигенов и антител в фосфоресцентном иммуноанализе.Добавки ПАВ влияют на фосфоресценцию Рд-порфиринов, Взаимодействие соединений порфириновой природы с различными типами ПАВ различается, Поэтому ПАВ влияют по-разному на фосфоресценцию различных Рд-порфиринов. Используя эти различия, можно подобрать ПАВ таким образом, что, измерив интенсивности или времени жизни фосфоресценции растворов, содержащих смеси Рс 1-порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ и без ПАВ, можно рассчитать содержание отдельных компонентов (индивидуальные порфирины или группы порфиринов), Для определения, например, трех различных порфиринов (или групп порфиринов) достаточно провести измерения фосфоресценции в трех различных системах, В данном случае это были буфер без ПАВ, буфер с добавкой 0,5% Тритона Х(неионогенный ПАВ) и буфер с добавкой 1 мМ цетилтриметиламмоний бромида (катионный ПАВ),При этом, что метод не универсален и применим лишь к определенным образцам, содержащим не очень сложные смеси порфиринов(2 - 4 компонента), Однако он хорошо подходит для первичного анализа образцов мочи, крови, экстрактов тканей, кала. Он позволяет существенно ускорить процесс первичного скрининга большого числа образцов (более 100 анализов в час), сделать его технологичным и автоматизированным. Выявленные образцы с аномальным распределением порфиринов далее могут исследоваться более подробно другими методами, в частности, хроматографическими (ВЭЖХ, ТСХ),Способ иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Получение палладиевых комплексов порфиринов, К 1 мл растворов копропорфирина 1,копропорфирина 1,уропорфирина или протопорфирина 1 Х (концентрация 1 - 100 нМоль/л) в 0,05 М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляли 0,01 мл раствора РОС 2 в 0,01 М НО, и инкубировали на водяной бане при 80 С 5 мин. Затем растворы охлаждали и добавляли 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе 6.5 - 7,5. Записывали спектры люминесценции растворов на спектрофлуориметреЯ.-50 (Регйп Е 1 пег) в диапазоне длин волн550 - 750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм, Исчезновение полос флуорес 5 ценции порфиринов (в области 620 нм) ипоявление полос фосфоресценции Рд-порфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, чтопорфирины полностью переходили в форму10 палладиевых комплексов.Процесс имеет оптимум по концентрации соли палладия в области 20-500 мкМРд . Эта концентрация является предпочтительной.15 Скорость включения палладия в порфирины зависит от температуры инкубации,Снижение температуры требуетувеличения времени инкубации. Например,для температуры 37 С для полного перехо 20 да порфиринов в палладиевые комплексысоставляет более 2 часов. Предпочтительные условия - 2 - 15-минутная инкубация при60 - 8 С,В ацетатном буфере включения палла 25 дия в порфирины проходит лучше, чем вцитратном, Изменение рН буферного раствора в диапазоне 3 - 6 не имеет существенного влияния на процесс,Измерение высокотемпературной фос 30. форесценции Рб-порфиринов в различныхбуферных системах, содержащих ПАВ. После превращения порфиринов в палладиевые комплексы и добавления сульфитанатрия (см,пример 1) измеряли интенсив 35 ность фосфоресценции растворов без ПАВи в присутствии добавок ПАВ, Спектры возбуждения и эмиссии, а также кинетики затухания фосфоресценции растворовРб-производных различных порфиринов в40 присутствии различных ПАВ и без ПАВ записывали на люминесцентном спектрометре 1.3-50 (РегЫп Е 1 тег, Англия).Измерение, интенсивности люминесценции проводили в режиме "Фосфорес 45 ценция" в условиях оптимума свеченияРб-порфиринов. Оптимальные условия измерения следующие: возбуждение при 395нм, регистрация при 667 нм время задержкипосле вспышки - 10-300 мкс; время счета -50 500-5000 мкс; время накопления сигнала -1-10 сек.. Измерения проводили в трех буферных системах: 1) система без добавок ПАВ; 2) то 55 же с добавкой 0,5 Тритона Х(ТХ - 100,неионогенный ПАВ); 3) то же с добавкой 1 мМ цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ,катионный ПАВ). Анионные ПАВ (типа додецилсульфата натрия) как правило слабо вэаимодеиствуютс поликарбоксильными биогенными порфиринами из-за электростатических затруднений и поэтому слабо влияют нафосфоресцентные свойства,Параметры фосфоресценции различных 5Рб-порфиринов в присутствии различныхтипов ПАВ, а также "удельные" интенсивности фосфоренсценции различных порфиринов в различных ПАВ приведены в таблице,Видно что, в отличие от свободных порфиринов, спектры возбуждения и эмиссииРд-порфиринов практически идентичны. Вто ке время интенсивности и время фосфоресценции порфиринов в различных буферных системах значительно различаются для 15одного и того же порфирина и между различными порфиринами или группами порфиринов, Такая особенность даетвозможность, измеряя в одних и тех же условиях интенсивности и/или времена жизни фосфоресценции растворов,содеркащих смесь порфиринов, в присутствии добавок различных ПАВ, рассчитатьконцентрации и/или соотношение отдельных компонентов, 25В описанных условиях чувствительность детекции Рд-порфиринов составляетпорядка 0,1 пикомоль/л, Максимальная чувствительность достигается в растворе с0,5; Тритона Х, поскольку в этом растворе порфирины фосфоресцируют наиболее интенсивно. Для способа-прототипачувствительность составляет 10 пмоль/л.П р и м е р 2. Селективное определениепорфиринов в их смесях, В пробирки, содержащие 1 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН5,0, 0,1 мМ РоС 2, добавляют по 0,05 млисследуемых образцов, содержащих известные концентрации копропорфиринов иуропорфиринов, и обрабатывают, как описано в примере 1, При этом порфирины переходят в форму Рб-комплексов,Из каждой пробирки отбирают 2 пробыпо 0,3 мл и переносят в полистирольныепробирки на 0,5 мл (СПп соп), В первые пробы добавляют 0,02 мл 10 мМ раствора ЦТАБ,а во вторые - по 0,02 мл 5 раствора Тритона Х - 100. После этого измеряют интенсивности фосфоресценции всех проб вусловиях, описанных в примере 2, и по реэультатам двух измерений рассчитываютконцентрации порфиринов в образцах. Дляэтого решается система линейных уравнений с двумя неизвестными - определяемыеконцентрации копропорфиринов и уропорфиринов: Ь 2 ф 1 - афигаЬг - а 2 Ьг аМ - ат 1аЬг - агфЬКоэффициентами уравнений служат "удельные" интенсивности фосфоресценции копропорфиринов (а 1 и а 2) и уропорфиринов (Ь 1 и Ь 2) в растворах ТХ - 100 и ЦТАБ, соответственно (см.Таблицу 1), определенные ранее в примере 2, Результаты селективного определения порфиринов соответствуют заданным значениям.Аналогичным образом могут быть определены порфирины в тройных смесях (копро-, уро- и протопорфирин), проводя для этого измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок измерения фосфоресценции в трех буферных системах: без добавок ПАВ, с добавкой 0,5 ТХ - 100 и . с добавкой 1 мМ ЦТАБ. Расчет концентраций компонентов осуществляют известным матричным методом решения систем линейных уравнений, Расчеты легко автоматизируются использованием ЭВМ.Производительность способа - около 100 образцов в час.П р и м е р 3. Определение порфиринов в моче, Способ осуществляют аналогично .примеру 2, используя в качестве образцов 0,05 мл мочи, По результатам измерения в трех буферных системах рассчитывают концентрации порфиринов в пробах.П р и м е р 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют.ацетат палладия в той же концентрации, Результаты не изменяются.П р и м е р 5, Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при.60 С, Результаты не изменяются.П р и м е р 6. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью палладия 2 часа при 37 С. Результаты не изменяются.П р и м е р 7. Способ проводят аналогичного примеру 1, но вместо сульфита натрия используют бисульфит натрия в той же концентрации 100 мг/мл, контролируя, чтобы после его добавления рН раствора был в районе 6,5 - 7,5, Результаты не изменяются.П р и м е р 8. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 1 мМ раствора ЦТАБ используют 1 мМ цетилпиридиний бромид катионный ПАВ), Результаты аналогичны.П р и м е р 9, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо 0,57 ь раствора Тритона Х - 100 используют 0,5 раствора Твина - 20. Результаты аналогичны.1803832 Люминесцентные свойство некоторых Рб - порфиринов. ПСРФИРИН макс. фосф.4,0 уро 1,П 1 8,10 0,51 0,56 15,10 АБ-ТХАВ- ТАБ 19,5 0,71 Тр-время жизни фосфоресценции; 1 уд - удельная интенсивность фосфоресценции 1 нМраствора порфирина. АБ-ацетатный буфер 0,05 М ацетат, 10 мг/мл сульфита натрия рН 7,0); АБ - ТХ-буфер АБ,содержщий 0,5 о. Тритона Х; АБ - ЦТАБ - буфер АБ содержащий 1 мМ цетилтоиметиламмоний бромида,П р и м е р 10, Способ осуществляютаналогично примеру 1, но вместо 1 мМ раствора ЦТАБ используют 0,1 мМ ЦТАБ. Результаты не изменяются,Таким образом, способ позволяет быстро и с высокой производительностью проводить анализ на содержание порфиринов вбиологических образцах (моча, экстрактыкрови, тканей, кала и т,п.) с целью выявления нарушений порфиринового обмена. 10Ф о р мул а из обрете н и я1. Способ селективного определениябиогенных порфиринов, включающий обработку образца химическим реактивом в растворе, возбуждение и регистрацию 15люминесценции порфиринов, по которойпроводят определение их концентраций, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности, упрощения и ускорения,анализа, образец обрабатывают в буфере с 20рН 3-6.избытком растворимой соли палладия Рб (И) при 37-100 С до полного превращения. порфиринов в их палладиевые 392 395 395 392 393 391 з 392 393 395 392 392 295 комплексы. проводят измерение фосфоресценции полученного раствора в присутствии сульфита или бисульфита натрия в конечной концентрации последнего 5 - 15 мг/мл при рН 6,5 - 7,5 при последовательном введении в раствор неионогенного поверхностно-активного вещества и катионного поверхностно-активного вещества и беэ введения в раствор поверхностно-активного вещества и по результатам измерений рассчитывают концентрации порфиринов матричным методом решения систем линейных уравнений,2. Способ поп 1, отл ича ющийся тем, что обработку образца, содержащего смесь протопорфирина, копропорфиринов и уропорфиринов ведут в ацетатном буфере в присутствии 20-500 мкмоль Рб (11) в течение 2 - 15 мин при 60 - 80 С, а в качестве поверхностно-активных веществ используют Тритон Хв конечной концентрации 0,2-1 О и цетилтриметиламмоний бромид в конечной концентрации 0,1 - 10 ммоль,667 667 667 667 667 667 667 667 667 667 667 667