Способ получения глюкозоизомеразы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик/2584101/28-13 (23) Приоритет 17.10,77 (32) 20,10,76 С 12 0 13/10 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытии(088.8) Дата опубликования описания 1509.80(72) Автор изобретения ИностранецЧин Ки Ли(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ 1Изобретение относится к способаммикробиологического получения ферментов изомериэации глюкозы и можетбыть использовано в пищевой промышленности для конверсии глюкозы вфруктозу, в частности при производстве фруктозных сиропов из кукурузного крахмала.Изомеразу глюкозы, применяемуюдля такой конверсии, получают измикроорганизмов, относящихся к различным родам, включая АгСЬгоЬаст.ег5 ггерйопусев, Вас 111 ця и Асй 1 порЬапеа,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности является способ 11, согласно которому в качестве продуцентов глюкоэоизомеразы используют микроорганизмы вида Е 1 агоЬас 1 ег 1 цп дечогапз,Недостатком известного способаявляется невысокий уровень активности штаммов, продуцирующих фермент. Целью изобретения является повышение ферментативной активности.Поставленная цель досткгается, тем, что в качестве продуцента глюкозоизомеразы используют штаммом Е 1 ачоЬасйег 1 цп агЬогезсепь АТСС 4358 2или Е 1 ачоЬасйегцп агЬогевсепь Ййй 1..В, или Е 1 ачоЬасег 1 цщ"агЬогезсепь Мйй(. В" 11023.Указанные культуры хранятся в5 Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 4358 и в Коллекции культур АйВ Северной региональной исследовательской лабораториИМинистерства земледелия США в Паории,10 штат Иллинойс, под 91 тйй 1. Вий й й 1. В3.Все три штамма продуцентов характеризуются сходными морфологическими, культуральными и физиологичес кими признаками.Палочки размером 0,5 х 2,5 мкм,: . одиночные и в цепочках, неподвижные,грамположительные, на стадавтныхпитательных средах образуют длинные,20 волйистые нити.На желатиновой среде колонии сна-чала нитевидные и ветвистые, затемцентр становится желтоватым, акрай - полупрозрачным и древовидным.25 Желатиновый столбик разжижается,плавится с образованием желтогоосадка.На жидком бульоне рост бактерийв виде суспенэии с желтым осадком,30 без тонкой пленки. Молоко коагулируют без подкисления. На картофелерост интенсивный в виде оранжевой"пленки. Нитраты не усваивают, нитриты не образуют. Аэробы или факультативные анаэробы.Оптимальная температура 30 С,В дополнение к укаэанному вышеГ. агЬогеьсепь АТСС 4358 характеризуется способностью к интенсивномусийтезу фермента при культивирова-нии на питательной среде, содержащейксилозу н качестве единственного углевода, на глюкозе или лактбэе активность фермента низкая, ШтаммГ. агЬогезсепз Мйй Впроявляет значительную изомеризующую ак"тивность при культивировании на питательной среде с лактоэой и малуюактивность на среде с глюкозой, ШтаммГ. агЬогевсепь Мйй Вхарактеризуется высокой изомеризующей активностью при культивировании на питательной среде, содержащей глюкозуили лактозу.Описанные микроорганизмы можно выращивать в различных средах, содержащих йыочники углерода, азота инеорганические соли. Типичная среда состоит иэ гидролиэованного животйого протеина,кукурузного сока,экстракта пивных дрожжей, дигидрофосфата калия и соответствующегоуглевода (ксилоза, глюкоза, мальтоэа, сахароза и лактоза, гидролизатыксилана, крахмала и целлюлозы). Начальный рН питательной среды долженравняться приблизительно 7, ферментацию следует проводить в аэробныхусловиях при температуре приблизительно 30 С в подходящем Ферментереили качалочной колбе. Максимальнаяактийность изомеразы достигается через 48-72 ч.Активность глюкозоизомеразы определяют путем инкубации при 60 оС втечение 30 мин смеси, состоящейиз0,5 мл содержащего фермент препаратаи 1,5 мл раствора, содержащего декстроэу (1,0 М), трициновый буферныйраствор (рН 8,01 М) и хлорид магйия(0,03 М). По истечении инкубационного периода реакцию изомеризациипрекращают путем добавления 0,5 мл1,0 н.раствора соляной кислоты. После центрифугирования всплывающуюпрозрачную фракцию разбавляют и определяют продуцированную Фруктозу. Активность глюкозоизомераэы выражаютв микроединицах, одна микроединицаактивности соответствует количествуФермента, необходимого для образования 1 мкг Фруктозы в 1 мин при приведенных выше условиях опыта,Найдено, что количество иэомеразы,продуцированное предложенными штаммами при благоприятных условиях культивирования, довольно эначйтельнои гораздо больше, чем количество,образуемое другими известными ранее продуцентами изомераэы. Особенно интересным и неожиданным является тотФакт, что максимальное продуцирование изоглераэы штаммом Мйй В достигаетсяв тех случаях, когда н 5 составе питательной сред применяютлактоэу. Например, н среде, содержащей 2 лактозы, ферментатийная активность составила 2892 микроединицизомераэы на 1 мл (мкед/мл 1 ферментационного бульона. Следовательно,штаммы согласно изобретению характеризуются и отличаются от известныхранее микроорганизмов тем, что могутпродуцировать значительные количества(500 мкед/мл бульона или более) 5 активной глюкоэоизомеразы при культивировании в питательной среде, содержащей лактоэу н качестве единственного источника Углеводов. Довольно значительное продуцирование фер мента происходит также при полномотсутствии углеводов в питательнойсреде. Это иллюстрируется данными,приведенными в табл, 1, полученнымипри культивировании при 30 С штаммовГ, агЬогеясепв и питательной среде,содержащей (% ) 1 гидролизонанногоживотного протеина, 1 кукурузногосока, 1 экстракта пивных дрожжей,1 моногидрофосфата калия, 0,5 дигид рофосфата калия и 2 угленодаГлюкоэоизомераэа, продуцированнаяГ. агЬогезсепв, проявляет высокуюактивность в интервале рН 6-10 и втемпературном интервале 45-90 С. Втабл. 2 показано нлияние рН, нтабл. 3 - температуры на активностьизомеразы, ассоциированной с цельными клетками, полученными путем культивирования Мйй Вв содержащейлактозу Питательной среде при 30 фС в 4 О течение 72 ч. Затем собранные клетки были промыты один раз и повторно суспендированы в воде до первоначальной концентрации клеток вферментационном бульоне. Для определения активности изомеразы применялась описанная выше стандартнаяметбдика определения за тем исключением, чтопри исследовании влиянця рН изменяли буферный раствор, апри исследовании влияния температуры изменяли температуру. Стабильностьизомеразы оценивали путем выдерживания промытых клеток н 0,05 М трициновом буфере, рН=8), содержащемхлорид магния (0,004 М) при разных 55 температурах с последующим периодическим отбором проб для определенияактивности Фермента, результаты приведены в табл. 4.Из данных табл. 4 видно, что феро мент существенно стабилен в течениепо меньшей мере 200 ч при рН 8 итемпературе 60 С, как установлено путем исследования промытых клеток,содержащиХ фермент. Препарат фермен та из промытых, клеток характеризует-./Продуцирование глюкозоизомеразы микроорганизмамиГ. агЬогевсепз Без углевода 4 2 7 546 силоза 12 9 люк 289 7 актоз. 0 оэа Сахаро Время продуцирования р и м е ч а ся, кроме того, тем, что, сохраняет по меньшей мере 85 активности при нагревании в течение 20 ч до темпе ратуры 70 С при рН 8.Изомераза, продуцируемая Г,. агЬогевсепз, очень эффективна для конверсии глюкозы в фруктоэу, и для такой конверсии могут быть применены различные способы, уже описанные ранее.П р и м е р 1. В колбу Эрленмейера емкостью 500 мп поместили 100 мп питательной среды следующего состава,Ъ: Гидролизованныйживотный протеинКукурузный сокДрожжевой экстрактКНРОКНрРО 4Лайтоза Указанную среду инокулируют свеже- приготовленным посевным материалом бактерий Г, агЬогевсепв ййй Ви инкубируют на качалке при 30 С.По истечении 72 ч клетки собирают и промывают. Активность иэсмераэы составила 2892 мкед/мл исходного бульона..П р и м е р 2, Повторяют опыт,описанный в примере 1, эа тем исключением, что в питательной среде лак- .тозу заменяют ксилозой и посевной материал готовят из Г. агЬогевсепаАТСС 4358. Через 72 ч клетки собира 5 ют и промывают, Активность иэомеразысоставила 546 микроединиц на 1 мпбульона,П р и м е р 3. Повторяют опыт,описанный в примере 1, за тем исключением, что в питательной среде лактозу заменяют глюкозой и посевный материал получают иэ Г. а гЬогевсейпз Мйй В. По истечении 64 ч ак тивность изомеразы составляла 580микроединиц на 1 Мл бульона. П р и м е р 4;Культивируют Г. агЬогезсепа ййй 1, Впри 30 С в течение 70 ч в ферментере пеи Вгцоаис 1 с емкостью 10 л с применением питательнофсреды, описанной в примере 1, Клетки собирают и иммобилизуют методом флоккуляции, описанным в патенте СШ 93821086. Получают агрегат высушенных флоккулированных клеток с активностью иэомеразы 75 микроединиц на 1 грамм.Таблица 1%РР 1 - натриевая соль 1,4-пиперазиндиэтансульфоната.Трицин - й-окси, 1-бис- (оксиметил)-этил-глицин.ТаблицаВлияние температуры на активнбсть изомеразыпродуцируемой Г. агЬогеьсеяв Май В, при рН 8,0 45 775 50 1717 55 2776 60 3500 65 4400 70 5104 75 5960 80 6592 85 7088 Таблица 2Влияние рН на активность изомеразы, продуцируемой Г. агЬогевсепв НВИВ764617 9 10 Таблица 43Стабильность ъомеразы, продуцируемой Г, агЬогвасепьййй В при разных температурах 340 2 2 22 2 3 22768 2262 0 ка ис аг 5 сйомера1 ЦВдчоЬд022,з ййй коэо Ьасй илиВ- геас яоизтив омера иромикрожащих минем иэвлеа юповыше ти, вВ мации,и экспертизе066,1976. Исто тые во Патент 95/31 Гпри кл тавитель Н.Паниковхред М.Рейвес Корректор Н.Стец ктор Е.Хорин.Тираж 522 Подпдарственного комитета СССРизобретений и открытийЖ, Раушская наб., д. 4/5 е Заказ 6317/52 ВНИИПИ по д 113035, Моилиал ППП "Патен формула изобретениСпособ получения глюкоз зы, предусматривающий куль ванне продуцирующих Фермен организмов на средах, соде :источники углерода, азо ральные соли, с последу чением Фермента, о т л щ и й с я тем, что, с ц ния Ферментативной акти стве продуцента глю льзуют штаммы Г 1 ао геьсепь АТСС 4358, тощ агЬогезсео Нй Г 1 ачоЬассегца агЬо 023,чники инфор я внимание прСША Р 395 1 опублин,ужгород, ул. Проектйая",