Способ определения активности антителообразующих клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1 б 917 А 1 01 й 33/5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ ВУ титутССР ательскии идицины АМНйцеховский оба, 1985, ч.79,(54) СПОСОБ О СТИ АНТИТЕЛО (57) Изобретен и и может найти практикедля оце го иммунитета изобретения явл способа за счет о ПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНО- ОБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК е относится к иммунологии применение в клинической нки состояния гуморальнои в биотехнологии, Целью яется повышение точности пределения количества и афстве субстра 1 а и- есрН 6,2 - 6,3(56) Оппп 0 по, Метр,195 - 204,Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в клинической практике для оценки состояния гуморального иммунитета и в биотехнологии,Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения количества и аффинитета антител, продуцируемых отдельной антителообразующей клеткой суспенэии.Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем иммобилиэацию антигена на нитроцеллюлозной мембране, культивирование на ней анализируемой клеточной суспензии, с последующим удалением клеток и выявлением пятен иммунных комплексов иммунопероксидазным методом, согласно изобретению в качестве субстрата в иммунопероксидазном финитета антител, синтеэируемых отдельной клеткой. Цель достигается тем, что анализируемую клеточную суспензию культивируют на нитроцеллюлозной мембране с иммобилизованным на ней антигеном, участки со связанными антителами выявляют, инкубируя мембрану с антииммуноглобулиновым коньюгатом и окрашивая и-фенилендиамином в буфере с рН 6,2 - 6,3, Мембрану денситометрируют, определяя для каждого пятна на ней максимальную оптическую плотность и диаметр на полувысоте пика оптической плотности, по этим данным определяют аффинитет антител и продуктивность каждой антителообразующей клетки, что в совокупности с количеством проявившихся пятен полностью характеризует активность популяции антителообразующих клеток, 2 табл. методе используют и-фенилендиамин в буфере с рН 6,2 - 6,3, нитроцеллюлозную мембрану денситометрируют, анализируют форму пика оптической плотности каждого пятна на ней, используя характеристики пика оптической плотности, численно решают уравнение диффузии антител по иммобилизованному антигену, и определяют.аффинитет и количество антител, продуцируемых каждой антителообразующей клеткой эа время эксперимента. Сумма продуктивностей всех антителобразующих клеток в совокупности с их количеством, полностью характеризует активность антителообразующих клеток в анализируемой клеточной суспензии.Использование в качефенилендиамина в буферпозволяет добиться максимальной чувствительности при выполнении иммунопероксидаэного метода, Выбор субстрата и условий был осуществлен в предварительных экспериментах с иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране пероксидаэой хрена, Максимальная интенсивность окраски была получена при использовании и-фенилдиамина в буфере с рН 6,2 - 6,3 (табл.1). Высокая чувствительность иммунопероксидаэного метода позволяет сократить время всесо способа, тем самым снизить ошибку неоднородности продукции антител, а интенсивная окраска пятен дает возможность провести детальное сканирование каждого пятна. Анализируя форму пика оптической плотности пятна, удается рассчитать с помощью предложенных формул, аффинитет и количество антител продуцируемых каждой клеткой за единицу времени. Тем самым охарактеризовать активность антителообразующих клеток в исследуемой клеточной суспензии двумя параметрами; количеством антителообразующих клеток в расчете на общее количество клеток и суммарной их продуктивностью, вычисленной с учетом аффинитета антител продуцируемых каждой отдельной антителообразующей клеткой, Таким образом, становится возможным в одном эксперименте полностью и точно охарактеризовать активность антителообраэующих клеток,Сущность способа заключается в следующем.Нитроцеллюлозную мембрану с сорбированным на ней антигеном, помещают на дно сосуда для культивирования клеток, куда затем вносят анализируемую клеточную суспензию в среде культивирования, После инкубации в атмосфере 5 углекислого газа при 37 С в течение 3 ч, мембрану промывают и переносят в раствор антииммуноглобулинового коньюгата на 16 - 20 ч. Затем тщательно отмывают и инкубируют с раствором пфенилендиамина в буфере с рН 6,2 - 6,3 в течение 5 - 10 мин. Реакцию останавливают, перенося мембрану в дистиллированную воду. Высушенную мембрану денситометрируют, определяя для каждого проявившегося пятна максимальную оптическую плотность (пятно учитывают если его максулмальная оптическая плотность не меньше 0,05) и диаметр на полувьсоте гака оптической плотности, Эти данные используют для численного решения системы уравнений, полученных из теоретических представлений о диффузии антител из точечного источника по антигену иммобилизованному на пористом носителег У 1 - е 641 1 О(у) С 1 У,.(у) бу =10 Ь 42 Ь(У) СУ где у - параметр интегрирования;1 о(у) - функция Бесселя;20 Я - концентрация связанных антител вцентре пятна;Л- коэффициент диффузии;К - константа связывания в реакции антиген-антитело;Н - концентрация иммобилизованногоантигена;0 - продуктивность клетки,с - время опыта;01 - шаг сканирования;30 О 2 - диаметр пятна на полувысоте оптической плотности,Решая систему уравнений, определяютКНо - величину, характеризующую аффинитет, и 0 - продуктивность, антителооб 35 разующей клетки (количество, г)иммуиоглобулинов, секретированное клеткой в единицу времени (с), Для этого оценивают недостающие параметры;коэффициент диффузии - в случае иммуног 40 лобулине 0 Л= 0,0 1 О с/ст),еремя ломте1=10800 с (3 ч); 01=8 10 см; 02 - определяется в эксперименте; 3 - величина, пропорциональная максимальной оптическойплотности пятна, определяемой в экспери 45 менте, Подставляя эти данные в уравнении, их решают численно, Программареализуется на ЭВМ типа ДВК - 3 или ВМРС. В результате для каждой антителообразующей клетки, оставившей на мембране50 "след" в виде окрашенного пятна, получаютвеличину, характеризующую ее продуктивность, с учетом аффинности секретируемыхантител, Сумма продуктивностей каждойантителообраэующей клетки и их общее55 количество в анализируемой клеточнойсусгензии полностью характеризуют активность антителообразующих клеток,П р и м е р 1. Предварительно готовятдиски нитроцеллюлозных мембран по раз 16917535 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 меру дна сосуда для культивирования клеток, Эти диски помещают на 2 - 3 ч в раствор антигена - очищенного вируса гриппа А/РЯ/8/34 (0,5 мг/мл вирусного белка в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,4). После чего диски тщательно отмывают в фосфатном буферном растворе 3 раза и 2 раза в среде культивирования (199 среда, содержащая 100 эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота). Влажные диски размещают на дно 6-луночного планшета для культивирования клеток, Отдельно готовят суспензию клеток из селезенки инфицированных вирусом гриппа А/РВ/8/34 мышей на 10 сутки инфекции. Суспензия содержит 10 клеток в 3 мл среды культивирования. В лунки планшета переносят по 3 мл суспензии, После чего планшет помещают СО 2-инкубатор (5 оСО 2; 37 С) на 3 ч. По окончании инкубации нитроцеллюлозные диски извлекают, маркируют и отмывают от осевших на них клеток в холодном физиологическом растворе, содержащем 10 мМ ЭДТА, Далее диски отмывают 4 раза в буфере с молоком (2 ч обезжиренного молока+ 1 ч забуференного фосфатами физраствора и помещают на ночь и ри 4 С в раствор антииммуноглобулинового коньюгата (антитела против дб мыши, меченные пероксидазой хрена в буфере с молоком) в рабочем разведении. Непрореагировавший коньюгат отмывают 4 раза буфером с молоком и 2 раза физраствором, Нитроцеллюлозные диски подсушивают и помещают в раствор субстрата (1 мг/мл ифенилендиамина в 0,1 М фосфатцитратном буфере р Н 6,25) на 7 мин, Реакцию останавливают, перенося диски в дистиллированную воду на 30 мин, после чего их высушивают и денситометрируют на лазерном денситометре Ультросан ( КВ, Швеция) с шагом 80 мкм, принимая эа пятно превышение оптической плотности над фоном на 0,05 ОЕ, Определяют максимум оптической плотности для каждого пятна, диаметр пятна на полувысоте пика оптической плотности и общее количество пятен на единицу площади фильтра, Сканирование и обсчет проводят с помощью разработанного пакета программ. Полученные для каждого пятна характеристики подставляют в систему уравнений(1), которую решают численно, на ЭВМ ВМ РС, определяя аффинитет антител и их количество, секретируемых каждой клеткой за единицу времени. Из расчетных данных, полученных в результате сканирования участка нитроцеллюлозной мембраны (4 см ), формируют таблицу(см.табл.2). В этой таблице каждой антителообразующей клетке, оставившей "след" на мембране, соответствует свой номер, значение пКН - характеризует аффинитет синтезируемых клеткой антител, С - продуктивность каждой клетки (количество секретированных иммуноглобулинов в единицу времени).,"Г, 0 - суммарная продуктивность проанализированных антителообразующих клеток, Сумма продуктивностей антителообраэующих клеток и их общее количество полностью характеризуют активность антителообразующих клеток в анализируемой клеточной суспензии (см,табл.1 и 2).Предлагаемый способ, по сравнению с известным, имеет ряд преимуществ. Способ позволяет анализировать аффинитет антител секретируемых отдельной антителообраэующей клеткой, и на основе этого определять истинное количество антител секретируемых каждой клеткой, Характеризовать активность антителообразующих клеток по двум параметрам: количеству клеток и их продуктивности.Способ разработан в лаборатории молекулярной биологии вирусов отдела молекулярной биологии НИИЭМ АМН СССР,Формула изобретенияСпособ определения активности антителообразующих клегок путем иммобилизации антигена на нитроцеллюлозной мембране, культивирования на ней анализируемой суспенэии клеток с последующим удалением клеток и определением активности антителосбразующих клеток по анализу пятен иммунных комплексов иммунопероксидазным методом окраски, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет определения количества и аффинитета антител, продуцируемых отдельной антителообраэующей клеткой суспенэии, в иммунопероксидаэном методе окраски иммунных комплексов в качестве субстрата используют, п-фенилендиамин в буферном растворе с рН 6,2 - 6,3, а пятно окраски антител от отдельной клетки денситометрируют и определяют максимальную оптическую плотность пятна и его диаметр на полувысоте пика оптической плотности с последующим вычислением по программе на ЭВМ количества и аффинитета антител отдельной клетки,1691753 Таблица 1 Таблица 2 Составитель П,БонарцевРедактор В,Трубченко Техред М,Моргентал Корректор И.Мус ул.Гагарина, 101 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Уж каз 392 ВНИИ Суммарная продуктивность, О = 25,6,Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5