Способ получения амикацина

(19 1)5 С 07 Н 15 МИТЕТОТКРЫТИЯМ ОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ЕИЗ ЕТЕН ИС К ПАТ л. %42А (1 Т)анджиа (1 Т)ий патент15/234. 0218292 А 1 СН дных саванного 3-амино=0-(6 л)-1-ф 4). дезоксикасается произ и, усовершенс ия амикацина (1 юкопиранозил-( -а-О-глюкопиран си-о ксибутил- ормулы 1; 0 И 2 0, 0 И который является си тиком и используетс Известен способ рованием защ ии канамицинм антибиотетическ в медици олученищенного в формулы амикацина Зи 6 - по 1ацили ложен тся упрощеода.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИКАЦИНА(57) Использование; в качестве синтетического антибиотика в медицине. Сущность Изобретение харов, в частност способа получен 3-дезокси-а-О-гл а мино-дезокси И -4-амино-ок 1 О-стрептомин фС 1 Ф 2 1776262 АЗ изобретения: продукт амикацин3-дезокси-а-О-глюкопиранозиламина-дезокси-с-О-глюкопирай -/4-амино-оси-оксибутил/1О-стрептомин). Реагент 1:А, защищенный бензилоксикв положениях 3 и 6. Реагент 2:зилоксикарбонил-Я+4-амино яной кислоты и й-оксисукцинимреакции: в среде воды и низшегна 1,СН 2 С 12, СНС 1 з, (СН 2 СЩ, рудаление защитных групп. 2табл., 2 рис.(О-амино- -(1 фб- (бнозил)-1-ф 4)- -2-дезоксиканамицин арбонилом эфир й-бен-Оксимасл ид. УСловия о хлоралка- Н 4,5-6,5 и з,п. ф-лы. 2 1 РО ОН В-СОСН 2 СБНЬ 0в где В - защитная группа, 0 .которое проводят обработкой солью бивалентного металла, реакцией полученного комплекса с производным 1+)-4-амино- Ф гидробутановой кислоты, где аминогруппа Ы защищена и оксигруппа активирована, с последующим разрушением комплекса и удалением ионов металла и защитных групп 11, Недостатком способа является его сложность и невысокий выход.Целью изобретения являение процесса и повышение выхПоставленная цель достигается тем, что ацилированию эфиром М-бензил-оксикарбонил- -(+4-амино-оксимасляной кислоты и М-оксисукцинймида, взятым в виде раствора в низшем хлоралкане, например, хлористом метилене, хлороформе или 1,2- дихлорэтане, подвергают непосредственно производное канамицина А формулы И, гдей СОСИ,С,Н,я0Анализ жидкостной хроматографией продукта проводят в следующих условиях:колонка: ВВ,5 мкм; 250 мм х 4,6 мм (Броунли Лабс),элюент: А) буферный раствор КН 2 РО 4 при 2,5 (1,36 г КН 2 РО 4, растворено в 1 л воды, доведено до желаемого рН 5 Я,-ной фосфорной кислотой, отфильтровано на фильтре с 0,45 мкм),В) Смесь ацетонитрила - буфера с рН 2,5 (80/20 объем/объем), скорость потока 2 мл/мин,градиент: от 15% В до 90 В за 15 мин, температура: 30 С,детекция: УФ/350 нм.дериватизирующий раствор: 2,4,б-тринитробензолсульфокислота в воде - пири- дине (50/50).На приложенных рисунках, на рис, 1 показан спектр жидкостной хроматографии, тогда как на рис. 2 показан ИК-спектр в КВг.Согласно предложенному способу не может образоваться изомеоный продукт амикацина, называемый ВВ-К 29, который является более токсичным, чем амикацин,Потенциально имеющимися примесями могут быть только продукт, называемый ВВК 11, и продукт, получаемый при двойном ацилировании у Ми М" - атомов.1+)-4-амина-оксимасляная кислота обозначена как 1:НАВА, ди(НАВА)КАМА-канамицин А, замещенный в 3 и 6 положении остатком 1:НАВА.П р и м е р 1. Суспензируют 53,4 г 3,6 -ди-Й-бензилоксикарбонилканамицина А в 1000 мл воды и растворенных в ней 38,5 мл уксусной кислоты, после 30 минут перемешиаания при комнатной температуре устанавливают рН равным б с помощью 30; МаОН (около 52 мл),После дополнительных 30 мин при комнатной температуре прибавляют за один раз 34.9 г М-бензилоксикарбонилНАВАМ-оксисукцинимида, растворенного в 1442 мл метиленхлорида.Затем смесь выдерживают всю ночь при интенсивном перемешивании при комнатной температуре, затем выпаривают органический растворитель при температуре 10 20 25 30 35 45 50 55 ниже 40 С и устанавливают рН равным 4,2с помощью уксусной кислоты,Проводят снятие трех бензилоксикарбонильных защищающих групп с помощьюстандартной методики, добавляя к раствору50 г 2,5 О Рб/С и прибавляя по каплям прикомнатной температуре 50 мл муравьинойкислоты. После фильтрации угля оп десантеи промывки водой получают 1900 мл обогащенных вод, имеющих следующий состав:амикацин 11,52 г/лканамицин А 2 г/лВ В-К 11 0,25 г/лди/НАВА/КАМА 1,3 г/лчто соответствует стехиометрическому выходу амикацина 65 О/, считая на исходныйдиацилат.Этот раствор абсорбируют на ионообменной смоле типа Зеролит (торговое название Ром энд Хаас) в слабокислой формепосле установки рН, равным 7,5.Канамицин элюируют при линейномградиенте аммиака от 0,5 н до 1,5 н и выходит он из колонки первым после амикацина.Собирают фракции 300-350 и концентрируют в вакууме для полного удаления всего аммиака и достижения конечнойконцентрации амикацина 20 ОД.Для подкисления до рН 2,5 используют50 мас, /, масс/объем серную кислоту и проводят обработку углем,После 30 минут перемешивания прикомнатной температуре уголь отфильтровывают, остаток промывают и осаждают метанолом дисульфат амикацина.После 2 часов пеоемешивания при комнатной температуре полученный белыйтвердый продукт отфильтровывают и послепромывки и сушки в вакууме при 45 С втечение 16 ч вес продукта составляет 33,3 г.Целевое основание амикацина составляет 68%, как определено жидкостной хроматографией (при микробиологическомтитре 690 мкг/мг), другие параметры находятся в соответствии с данными для амикацин сульфата,П р и м е р 2, Суспендируют 50 г 3,6 -ди-М-бензилоксикарбонилканамицина А,имеющего по данным жидкостной хроматографии содержание 89,5(59,3 ммоля),содержание воды 3,3% и содержащего в качестве основной примеси 1,3,6-три-М-бен 1эилоксикарбонилканамицин А, в 1500 млдеионизированной воды. После 30 мин перемешивания прибавляют ледяную уксусную кислоту в количестве, необходимом дляустановления величины рН, равной б + 0,2.В этой точке практически получают раствор; Прибавляют активный сложный эфирМ-оксисукцинимида 1 -/-/-гамма-бензилок 1776262сикарбонил амино-альфа-оксимаслянойкислоты при комнатной температуре в видераствора в метиленхлориде (25 г соответствует 80,6 ммоля) в 1000 мл растворителя,Смесь интенсивно перемешивают в течение 2 ч и выдерживают при перемешивании всю ночь.После отделения органической фазы устанавливают рН 10 с помощью 3 н. растворааммиака. 10Образовавшийся при этом белый осадок отфильтровьвают на воронке Бюхнерав вакууме и промывают водой.Слабокристаллический продукт сушат ввакууме при 30 С в течение примерно 30 15часов.Получают 30,9 г 3,6 -ди-И-бенэилоксикарбонил-К/-/-у-бензилоксикарбониламино-а-оксибутирол)-канамицина А,имеющего титр 70% (жидкостная хроматография).Основными примесями являются:исходный диацилат: 10 триацилат(М, йи Мс бензилоксикарбонильными группами); 2;/ 25потери при сушке: 4-5% (3 часа при105 С),сульфатная зола; 0,15%.П р и м е р 3. 53,4 г З,б-ди-й-бензилок 1сикарбонилканамицина А (анализ 89,5 , 3063,4 ммоля) суспендируют в 1000 мл воды ирастворяют в 38,5 мл уксусной кислоты, после чего в течение 30 мин перемешиваютпри комнатной температуре, а рН доводятдо значения, указанного в табл, 1, с помощью 30% йаОН,Затем перемешивают еще 30 мин прикомнатной температуре и одновременнодобавляют 34,9 г М-бензилоксикарбонил-йНАБА-й-гидроксисукцимида, растворенного в 1442 мл метиленхлорида,Затем смесь энергично размешиваютпри комнатной температуре в течение ночи,после чего органический растворитель выпаривают при температуре ниже 40 С, а рН 45доводят до значения 4,2 с помощью уксусной кислоты,Разблокировку трех бензилоксикарбонильных групп осуществляют стандартнымспособом путем добавления к раствору 50 г 502,50 Рб/С и добавления по капле при комнатной температуре 50 мл муравьиной кислоты,После фильтрации угля на декалите ипромывания водой получают прозрачный 55раствор с композицией реакционных продуктов, описанных в таблице в соответствиис различными значениями рН во время стадии ацилирования. Раствор абсорбируют на ионообменнике типа гего 1 т (торговая марка ВОНУ и НААЛЕ) (после того как рН доводят до значения 7,5) в слабокислотной форме,Канамицин элюируют с использованием линейного градиента аммиака от 0,5 й до 1,5 И с выпуском иэ колонки сначала канамицина, а затем амикацина.Фракция 300-350 собирают и концентрируют в вакууме с целью полного удаления аммиака и достижения конечной концентрации амицина 200 ,Затем осуществляют подкисление при рН 2,5 с использованием 50 масс./об. Н 2504 и обработку активированным углем.После 30 минутного перемешивания при комнатной температуре уголь отфильтровывают, остаток промывают, а дисульфат амикасина осаждают метанолом,После 2-часового размешивания при комнатной температуре, полученное белое твердое вещество фильтруют, промывают и высушивали в вакууме в течение 16 часов при 45 С, после его указанное вещество имеет массу, указанную в последней колонке таблицы 1.Анализ амикацинового основания, про- веденный с помощью жидкостной хроматографии (с микробиологической активностью 690 мкг/мг) показывает 68%, что находится в соответствии с другими определениями.П р и м е р 4, 53,4 г 3,6-ди-й-бензилоксикарбонилканамицина А 88%, 62,4 ммоля) суспендируют в 100 мл воды и растворяют в 38,5 мл уксусной кислоты, после чего в течение 30 минут перемешивают при комнатной температуре, а рН доводят до значения 6 с помощью 300 йаОН,Затем после 10-минутного перемешивания очень быстро добавляют 35 г И-бензилоксикарбонил-:НАВА-И-гидроксисукцинимида, растворенного в 1220 мл хлороформа.Смесь энергично размешивают в течение 4 часов, затем выделяют растворитель путем дистилляции при температуре ниже 40 С, а рН доводят до значения 4,2 с помощью уксусной кислоты.Удаление трех бензилоксикарбонильных защитных групп осуществляютстандартным способом путем добавления к раствору 50 г 2,5 Рб/С и добавления по капле при комнатной температуре 50 мл муравьиной кислоты,После фильтрации угля на декалите и промыва ия водой получают полный раствор (1850 мл) со следующими композициями:Амикацин 12,12 г/л,Канамицин А 2,1 г/л, 1776262После фильтрации угля получают раствор (2500 мл), содержащий следующие компоненты:Амикацин 14,0 г/л,Канамицин 4 г/л, .ВВ-К 11 0,41 г/л,ди(НАВА)КАИА 1,8 г/л, 55что соответствует стехиометрическому выходу амикацина 59,7 о .Амикэцин выделяют из родственных побочных продуктов с помощью адсорбции наионообменнике типа Еего 1 т(Торговая марка РОНУ и НААЛЕ) в слабокислотной форме (после доведения рН до 7,5).Фракции, содержащие амикацин собирают и концентрируют в вакууме для удаления аммиака.Амикацин при концентрации 15 мас.о обрабатывают 50 мас, оН 2 ЯО при рН 2,5 ипосле обработки эктивированным углемкристаллизуют.После 2-часового рэзмешивания прикомнатной температуре получают белоетвердое вещество, которое фильтруют ипромывают метанолом, после высушиванияв вакууме при 45 С поскучают 51,3 г амикэцинсульфата;В табл, 1 представлены результаты проведения опытов при различных рН.Ацилирование, проводимое всоответствии со способом настоящего изобретения,3,6 -ди-Н-замещенного канамицина А в условиях контролируемого рН и в гетерогенной фазе, обеспечивает стереоселективность, которая является неожиданно высокой, так как предпочтительно образуетсяамикацин вместо ВВ-К 11 или продуктов,происходящих из двойного ацилирования уКи К- атомов, Кроме того, очень важным является тот факт, что согласно настоящему способу в конечном продукте можетприсутствовать в качестве возможной примеси только продукт, называемый ВВ-К 11, ипродукт дицилирования в Ки М" в положениях, токсичность которых ниже, чем упродукта, называемого ВВ-К 29, который является основной потенциальной примесью,которая образуется в соответствии с другими известными способами синтеза.Предложенный способ дает хорошиепоказатели по выходу и чистоте продукта,является особенно безопасным с точки зрения промышленнь 1 х гигиенистов, так как используют почти безвредные, реагенты ирастворители и способ легко осуществляется, так как не нужно выделять промужеточные продукты,Проводят несколько экспериментов длясравнения летальной дозы, токсичности иострой общей переносимости (телерактности) продукта, доступного в продаже от фирмы Б ристол ь Майерс (В В-КВ), а мика цина,полученного в соответствии со способом настоящего изобретения, и потенциальныхпримесей (ВВ-К 11, ВВ-К 29 и диацилат с :НАБА в Йи й"), на мышах при внутривенном введении (каудальная вена) нагруппе из 10 животных. Величины ЛД 5 о вычисляют по методу Финней-Пробитса.Результаты представлены в табл,2.Приведенные выше данные показывают, что по предлагаемому способу получают17762 б 2 10 СН,НСОС 5 1.ы и включающии 10 ной температу й-бензилоксик имаслячной ки взятом в виде не, с"последу 15 групп,отлич упрощения пр целевого прод 4,5 - б,5 подве изводное кана 20 2, Способ и на А, за-, тем, что в каче зилокси- пользуют хлор или 1,2-дихлоран ой ацилиров ре в водн арбонилслоты и К- раствора в ющим уда ающийс оцесса и и укта, ацил ргают неп мицина А ф ОН6 ф 2 0ОК исходя из производн щищенного в 3 и б по карбонилом формулы оп,1,тве ниистыитан,канами жении б блица блица 2 Составитель Н.НарышковаТехред М,Моргентал Корректор Л.Ливринц едактор А.Бер Тираж Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям.при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 аказ 4046 ВНИИП роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 конечные продукты, у которых возможные примеси, хотя они и имеются в конечных продуктах в очень незначительных количествах, являются всегда намного менее ток-сичными, чем ВВ-К 29, который может присутствовать и ри известных синтезах.Формула изобретенияСпособ получения амикацина формуие при комнатсреде эфиром -(+4-а мино-оксоксисукцинимида, низшем хлоралкапением защитных я тем, что, с целью овышения выхода ированию при рН осредственно проормулы Н.личающийся его хлоралкана истилен, хлороформ