Способ отделения полирибосомных информосом от свободных

50 Изобретение относится к молекулярной биологии к биохимии и может бытьиспользовано для изучения регуляциибиосннтеэа белка в клетках зукариоти"5ческих организмов,Цель изобретения - повьппение чисто ты целевых продуктов.Поставленная цель достигается спомощью диссоциации полирибосом, свяэанных с твердым иммуносорбентом длярибосом (твердофаэной диссоциациейполирибосом), известными агентами,Препарат цитоплазматическкх рибонуклеопротеидон инкубируют с твердымиммуносорбектом, При этом полирибосомы, рибосомы и их субчастицы, присутствующие в препараты, связывают-ся с ним. Жидкую фазу, содержащуюсвободные информосомы, отделяют оттвердой колоночной хроматографией илицентрифугированием, после чего проводят твердофаэную диссоциацию полирибосом известными агентами. Полирибосомные информосомы, освободившиеся 25от полирибосом в процессе диссоциации их ка рибосомные субчастицы, переходят в жидкую фазу, Те рибосомкые,субчастицы, которые образовались врезультате диссоциации полирибосом ирибосом и до этого не были непосредственно связаны с иммуносорбентом всоставе рибосомы, тоже переходят вжидкую, фазу.и,загрязняют освободившиеся полирибосомкые информосомы, Поэтому необходим избыток твердого им 35муносорбента для их связывания, который устанавливается опытным путем,Жидкую фазу с освободившимися полирибосомными информосомами отделяют от40твердой колокочной хроматографиейили центрифугированием.Источники цитоплазматических информосом (клетки, ткани, органы, целые организмы) инкубируют с радиоактивным предшественником информосомв течение 20-30 мик.П р и м е р 1. Отделение полирибосомных информосом от свободных из листьев гороха.Получение цитоплазматических рибонуклеопротеидов.10 г зеленых листьев гомогенизируют.в буфере, содержащем 200 мИ Трисрн 8,5, 150 мМ КС, 5 мИ МКС 5 мИ2-меркаптозтанола, 250 мИ сахароэы и5 мкг/мл циклогексимида. Объем буфе-ра 20 мг. Гомогенат фильтруют черездва слоя нейлона и жидкость центрифугируют при ЗООО ц в течение 5 мин, Надосадочную жидкость фильтруют и центрифугируют при 23000 ц в течение 20 мин в роторе Ф 50 Надосадочную жидкость обрабатывает Тритоном Х(0,53) в течение 10 мик и центрифугируют при 105000 я в течение 4 ч в роторе БУ 50.1. Для мечекия Ы чьего осадок цитоплазматических рибонуклеопротеидов суспендируют в буфере, содержащем 50 мМ НЕРЕБ, рН 7,8, 10 мИ КС 1, 10 мМ Мяс 1, 5 мМ дитиотрейтола, 5 мкг/мп циклогексимида, 0,25 мМ фенилметилсульфонилфлюорида, 0,025 мИ лейпептина, 15 ед. РНКаэина. Агрегаты удаляют центрифугированием при 15000 я в течение 15 мин, 1-5 Ар ед. рибонуклеопротеидов.инкубируют со смесью, содержащей 12 ед, Т 4 РНК-лизагы и 100 икКи 3, 5(5- эР) цитидиндифосфата, приготовленной на буфере для суспенднрования. Объем смеси 30 мкл. Реакцию мечения проводят при +28 ОС в течение 30 мин. Для остановки реакции смесь охлаждают до +2 С, и разбавляют в 1 О раз буфером для суспендирования без РНКазина и подвергают иммуноаффинной хроматографии,Выделение цитоплаэматических рибосом для иммунизации кроликов.10 г зеленых листьев гомогенизировали в 20 мл буфера, содержащего 200 ьИ Трис, рН 7,3, 150 мМ КС 1, 5 мИ Мас 1, 5 мИ ИЭТ. Гомогенат, фильтруют через два слоя нейлона и цент- . рифугируют при 3000 я в течение 5 мин, Надосадочную жидкость центрифугируют при 23000 ц в течение 20 мин в роторе БИ 27. После удаления липидного слоя кадосадочную жидкость сливают и обрабатывают Тритоном Хдо конечной концентрации 0,57-в течение 10 мин. Наслаивают на 1 М сахароэу, приготовленную на буфере для гомогенизацки, и центрифугировали при 105000 ц в течение 1,5 ч в роторе БЧ 50.1, Осадок суспекдировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,4, 250 мМ Иас 3., 5 мИ Мяс 1, 1 мМ ИЭТ. После удаления агрегатов центри;. фугированием 50-75 А ед. рибосом наносят на градиент концентрации са" хароэы 15-303, приготовленный на буфере для суспендирования, и цектри" фугируют при 100000 фц в течение 195,мин в роторе БУ 27, Градиенты фракционируют по 1,3 мл и после измерения Аи во фракциях отбирают ки1423 ковые фракции монорибосом, разбавляют буфером рля суспендирования с20 мМ БаС 1 вместо 250 мМ БаС 1 в двараза. Разбавленные фракции замораживают при -75 С до иммунизации. Иммунизация кроликов. 1 мг рибосом смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и несколько. раз пропускают через иглу шприца. Препарат ц)вводят в объеме 0,5-1 мл внутримьппечно в оба бедра и под обе лопатки.Инъекции антигена повторяют еженедельно в течениемес. без адъюнанта в те же точки. Через 1 нед. после 5последней инъекции берут кровь краевой вены уха и определяют наличиеантител по двойной иммунодиффузии поУхтерлони. После месячного перерывацикл повторяют с 0,5 мг рибосом. За 20неделю перед каждым взятием кровипроводят подстегивающие инъекцииантигена,Приготовление иммуносорбента.Протеин А-сефарозу С 1 4 В ("Фариация" Швеция) эамачивают и отмываютсогласно инструкции фирмы, затем промывают буфером, содержащим 20 мМ К-.Ма-фосфат, рН 7,6, 140 мМ БаС 12,5 ил протеин А-сефарозы насыщают 3 р1 яО, выделенным из иммунной сыворотки по А.Боо 1 пу Вазз Ехегсзез ЫЬшвцпосЬешхз 1 гу. А ЬаЬогаСогу Мапцв 3ВегЫп НеЫе 1 Ьегя .Беч ЮогХ, 1979,р. 1-19, либо к этому количеству про- З 5теин А-сефарозы добавляют 4 мл иммунной сыворотки. В обоих случаях инку-бацию антител с носителем проводятв течение 30-60 мин в колонке из полипропипена (наконечник С 6000, 6 фк 1,25 см, Пипетман фирмы "Жилсон")с фильтром из распущенного мираклозана дне. Дпя удаления несвязавшихсябелков колонку промывают вьппе приведенным буфером (фосфатным) до техпор, пока поглощение элюата при280 нм не снизится до постоянногоуровня. Затем колонку промывают буфером, содержащим 20 мМ ТЭА, рН 7,6,25 иИ КС 1 5 мМ МКС 1 1 мИ МЭТе" 5 ОПроцедура иммуноаффинной хроматографии.Из раэбанленной в 10 раэ реакционной смеси общим объемом .300 икл (ме-ченый препарат цитоплазматических ри" 55бонуклеопротеидон) берут аликвоту н20 мкл и фиксируют формальдегидои доконечной концентрации 4 Х в течение24 ч для анализа в градиенте плотнос 05ти СзС 1, а также две аликвоты 5 и1 О мкл для измерения радиоактивности.Оставшуюся часть. доводят до объема1,5 мл ТЭЛ в . буфером, которым пройывают колонку. Буфер из колонки отсасывают и вносят 1,5 мл препарата (5Ао ед., 2-5 0 имп./мин). Инкубацня продолжается в течение 30-60 мин при +2 СЗатеи отсасывают фракцииэлюата по 1,5 мл до снижения радиоактивности до постоянного уровня(для измерения радиоактивности берут апикноты из каждой фракции злюата),.добавляя после отсасывания столькоже ТЭА-буфера. Таким образом отделяют свободные информосомы. Фракцииэлюатов со снободными информосомамификсируют 4%-ным формальдегидои дляанализа в градиенте плотности СзС 1,Дпя получения полирибосомных информосом, из колонки отсасывали предыдущий буфер и вносили столько.же буфера, содержащего 90 мМ К, Ма-фосфата, 0,5 мМ МдС 1,мМ КС 1, рН 7,6.Связанные с иммуносорбентом полирибосомы инкубируют с этим же буфером в течение 30-60 мйн при +2 С (твердофазная диссоциация). Элюцню фосфатным.буфером, проводят путем отсасывания, как описано вьппе. Для анализа в градиенте плотности СзС 1 порции фосфатного элюата обязательно диализуют против буфера, содержащего 20 мМ ТЭА, рН 7,6, 26 мМ КС 1, 5 мИ МдС 1, 1 мМ МЭТ и 4 формальдегида . (перед диалиэом во фракции фосфатного элюата добанляют формальдегид до конечной концентрации 4 Х).Полученные результаты идентичны результатам, полученным на зародышах пшеницы (см. пример 2).П р и м е р 2, Фракцию 116 кроличьих антител или антисыворотку к рибосомам эародьппей пшеницы инкубируют с протеин А - Сефароэой С 1-4 В (Фармация, Швеция) согласно инструкции фирма. Для элюции свободных информосом колонку.с иммуносорбентом промывают буфером, содержащим 20 мМ триэтаноламина, рН 7,6, 25 мМ КС 1, 5 мИ МяС 1и 5 мИ,2-меркаптоэтанола. В тои жебуфере в колонку с иимуносорбентоивносят 10 Апоопт. ед. препарата цитоплазматических рибонуклеопротеидовиз прорастанших в течение 12 ч и меченых 5-Н-уридинои зародышей пшеницы, Такое количество рибонуклеопротеидон достаточно для создания иеобхо"димого избытка с 2,5 мл иммуносорбента при титре антнсыворотки более 500, определенному с помощью двойной иммунодифузии по Ухтерлони. Инкубацию рибонуклеопротендов с иммуносорбентом проводят при 2-3 С в течениео1 ч при периодическом помешивании. Затем отсасывают порции по 1-2 мл до снижения радиоактивности до постоянного уровня, добавляя при этом в колонку столько же этого буфера. Дпя получения полирибосомных информосом колонку с иммуносорбентом затеи переводят в 90 мМ К, Иа-фосфатный буфер, рН 7,6, при соотношении 1 мл фосфатнога буфера намп влажного иммуносорбента,. так, чтобы диссоциировать полирибосомы в течение 0,5-1,0 ч. Элюцию полирибосомйых информосом проводят фосфатным буфером также,как .описано выше, до снижения радиоактивности до постоянного уровня, Для анализа в градиенте плотности СзС 1 порции элюата диализуют против триэтаноламинового буфера. В качестве твердого носителя используют протеин - А - Сефарозу С 1-4 В (" Фармация", Швеция).Главной характеристикой цитоплазматических информосом является значение их плавучей плотности в гради" енте СзС 1, равное 1,40-1,47 г/смз . Фиг, 1 дает представление о характере элюции свободных ( а ) и полирибосомных (б 1 информосом (на этой и последующих фиг. прерывистая линия- радиоактивность, имп./мин; сплошная линия - поглощение при 260 нм (А ),260 линия, прерывающаяся крестиками - плотность (р), г/см, по оси абсцисс - порции элюата, мп или фракции градиента плотности СзС 1. Видно,что основная масса свободных информосом (фиг. 2) элюируется в первыхтрех порциях, затем их количествоснижается до постоянного уровня. Ясли в это время провести твердофазнуюдиссоциацию полирибосом, то величина1 О радиоактивности снова повышается почти до первоначального уровня; чтосвидетельствует об освобождении изполирибосом какнх-то РНК-связывающихструктур, Анализ в градиенте плотности-СзС 1 этих структур показывает, чтоони являются информосомами (фиг.3),Как видно из фиг. 2 и 3, информосомыне загрязнены рнбосомным материалом,обнаруживающимся по поглощению при20 260 нм в зоне плотностей 1,521,56 г/см,Формула изобретения2 Способ отделения полнрибосомныхинформосом от. свободных путем аффинной хроматографии, включающий диссоцнацню полирибосом, ннкубацию в буферном растворе и элюцию целевых продуктов, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения чистоты целевых продуктов, перед диссоциацией.проводят инкубацню с нммуносорбентомдля рибосом до полного связывания35рибосомного материала затеи отделяУют свободные информосомы иэ жидкойфазы, проводят твердофазную диссоциацию связанных полирибосом смесью90 мМ К-Ба-фосфатного буфера с 0,5 мИ40 хлорнда магния и 1 мМ хлорида калия,рН 7,6 при 0-4 С,,За Тираж 492 ИИПИ Государственногопо делам иэобретений, Москва, Ж, Раушс Подписноомитета СССР открытийая наб., д, 4/ 30 Проиэводственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4