Способ получения комплексного ферментного препарата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы е. coli

837066 40 1Известен способ получения аденилаткиназы из мышц кролика, включающий /следующие стадии: 501) получение грубого экстракта изгомогената мышц экстракцией растворомЯаС 1;2) рН-фракциоиирование;3) фракционирование ацетатом цинка;4) экстракция цитратом аммония;5) первое фракциониронаиие сульфатом аммония в количестве 0,58 от степени насыщения; токиназы и аденилаткиназы, из биомассы Е. со 11, широко используемых для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).Известны способы выделения и очистки ацетокиназы и аденилаткиназы в от-. дельности.В частности, известен способ получения аденилаткиназы из биомассы Е. со 11, состоящий из следующих ста1) разрушение клеток биомассы в го - могенизаторе под вакуумом;2) удаление клеточных остатков центрифугированием, получение супернатанта - так называемого "грубого экстракта"3) фракционирование сульфатом ам-мония (60-68 );4) гель-хроматография на сефадексе 20 С;5) первая хроматография на ДЭАЭ- целлюлозе.; .6) вторая хроматография на ДЭАЭ- целлюлозе; 257) хроматография на гидроксилапатите;8) изоэлектрофокусирование.Полученный по такой схеме фермент - адеиилаткиназа - имеет удельную актив-З 0 ность 620 Е/мг (здесь и далее для всех ферментов приводятся единицы акмкмоль субстрата )тивности Е -мг белка х минНедостатками способа получения аденилаткиназы является его многостадийность и сложность очистки, а также крайняя нестабильность получаемого фермента, что делает невозможным его использование для синтеза АТФ,Дпя прикладных целей (например, дляФерментативного синтеза АТФ изАМФ)обычно используют аденилаткиназу измьзпц кролика (миокиназу) ввиду ее 45большой стабильности,6) второе Фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,88 от степени насыщения;7) диалиэ сорбция и десорбция на смоле 1 КС(ХЕ 64);8) третье фракционирование сульфатом аммония.Полученный таким образом фермент имеет удельную активность 1500 Е/мг.Недостатками данного способа получения аденилаткиназы являются многостадийность, сложность выделения фермента и использование в качестве источника фермента пищевого продукта (мьппц кролика).Известен также способ получения ацетокиназы из биомассы Е. со 11, состоящий из следующих стадий:1) получение грубого экстракта из биомассы;2) первое фракцйонирование ацетоном в количестве 40-55 ;.3) первое фракциоиирование сульфатом аммония (О,5-0,6 насыщ.);4) второе фракционирование ацетоном в количестве 50-55%;5) второе фракционирование сульфатом аммония (0,5-0,6 насыщ.);6) третье Фракционирование сульфатом аммония (0,49-0,53 насьпц.).Полученный таким образом Фермент - ацетокиназа - имеет удельную активность 220 Е/мг.Недостатками способа являются многостадийность и использование метода фракционирования белков ацетоном, который является весьма сложным в исполнении, так как строго зависит от температуры, Кроме того, использование легковоспламеняющихся жидкостей, особенно при увеличении масштабов технологии,значительно ее усложняет.Полученные вьппеуказаниыми способами высокоочищенные ферменты-аденилаткииазу 23 и ацетокиназу 1".3 1 иммобилизуют на ВгСИ-сефарозе и используют для получения АТФ ферментативным фосфорилированием аденозинмонофосфата или аденозиндифосфата путем пропускания через реактор с иммобилизованными Ферментами реакдионной смеси, содержащей АМФ или АДФ, ацетилфосфат, ионы М 8+ и буфер трис-НС 1 4, 5. Производительность реактора составляет 24 г АТФ в сутки, чистота АТФ 96-97 ,Однако данный способ нельзя признать достаточно экономичным и технологически удобным, поскольку он основан5 83706на использовании ферментов высокойстепени очистки (что, как показано авторами изобретения, совсем не обязательно) и выделяемых из разных источ-.5ников трудоемкими и многостадийнымиспособами, причем один из источниковферментов является пищевым продуктом.Основной недостаток всех известныхспособов получения ацетокинаэы и аде Онилаткиназы заключается в использований биомассы только для выделения одного фермента, результатом чего является неоправданно большое количествоотходов. 15Кроме того, все известные способыявляются многостадийными и в. силу этого трудоемкими и дорогостоящими, Дляприкладных цепей - для синтеза АТФ иэАМФ, целесообразно использовать не 20высокоочищенные ферменты, а лишь ча. стично очищенные препараты ферментов,в силу простоты и низкой стоимости ихполучения. Поскольку и ацетокиназа иаденилаткйназа присутствуют в значйтепьных количествах в Е. со 1., причемоба эти фермента широко используютсядля прикладных целей .(например, сйнтез АТФ из АМФ), нет необходимостив очистке каждого из ферментов в отдельности, выгоднее сразу получатьпрепарат, содержащий оба фермента.Изобретение экспериментально показывает возможность использования частично очищенных ацетокиназы и аденилаткиназы, выделенных из одного источника-биомассы Е. со 1, для синтезаАТФ,Целью изобретения является разработка нового способа получения комплексного ферментного препарата-ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассыЕ. со 11.Цель достигается новым, не описанным ранее в литературе способом получения комплексного ферментного препарата ацетокинаэы и аденилаткиназы иэбиомассы Е. со 1, заключающимся. в,том, что биомассу Е. со 1,разрушаютпутем обработки ее раствором лнзоцима 50в трис-НС 1 буфере рН 7,48-7,5 содержащем 0,1-0,15 М КС 1, и действиемультразвука с частотой 16-18 кгц, отделяют клеточные остатки центрифугиройанием, полученный супернатант обрабатывают стрептомицинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-703 отнасыщения с последующим растворением 6 6осадка ацетокинаэы и аденилаткинаэы путем разбавления суспензия белков двукратным объемом трис-НС 1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37 и удалением нерастворивиегося осадка.Обычно стрептомицинсульфат используют в количестве 1-33.Существенными отличиями способа являются разрушение биомассы Е. со 1раствором лизоцима в трис-НС 1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем 0,1-0,15 М КС 1, и действием ультразвука с ча - стоъой 16-18 кгц,. отделение клеточных остатков центрифугированием, обработ-: ка полученного супернатанта стрептомицинсульфатом, осаждение белков сульфатом аммония в количестве 68-703 от насыщения, растворение осадка ацето" киназы и аденилаткинаэы путем разбавления суспензии белков двухкратным объемом трис-НС 1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30- 37 . и удаление нерастворившегося осадка.3Таким образом, ацетокиназу и аденилаткинаэу получают комплексно на основе совместной грубой очистки иэ одного источника, а именно, из биомассы Е. со 1. Это позволяет избежать трудоемких стадий очистки аденилатки казы и ацетокинаэы в отдельности и удешевить процесс за счет исключения дорогого и дефицитного сырья - иышц кролика и сокращения расходов иа реагенты и .оборудование.Описываемый способ получения ферментного препарата, содержащего аденйлаткиназу и ацетокиназу, заключается в следующем: биомассу Е. со 1 МКЕ разрушают сначала лизоцимом, а затем ультразвуком в трис-НС 1 буфере, содержащем 0,1-0,15.М КС 1 (для полноты экстракции белков) и получают грубый экстракт. Такой способ разрушения биомассы позволяет выделить на стадии грубого экстракта в 10 раз большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы по сравнению с разрушением биомассы только лизоцимом или только ультразвуком, Грубый экстракт обрабатывают 3%-ным раствором стрептомицинсулЬфата дпя удаления нуклеиновых кислот, Затем проводят фракцнонирование сульфатом аммония в следующем порядке: сначала осаждают белки при концентрации сульфата аммония 68-70 насыщения, а затем растворяют осажденныебелки доведением концентрации сульфата аммония до 30-37% насыщения. Такая, последовательность Фракционирования сульфатом аммония позволяет получить в 2-3 раза большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы, чем при фракционировании сульфатом аммония в обычно принятой последовательности; сначала осаждение более 1 О низкой концентрацией, а затем - более высокой. Полученную фракцию белков используют как ферментный препарат. Ферментный препарат, полученный описываемым способом, содержит ацетокиназу с 5 удельной активностью 20-25 Е/мг и аденилаткиназу с удельной активностью 30-40 Е/мг. Полученный Ферментный препарат может быть успешно использован для синтеза АТФ из АМФ и ацетилфосфа та. Для этого Ферментный препарат, предварительно обессолив на колонке с Сефадексом 6-25 и одновременно произведя смену буфера, иммобилизуют известным способом. 5 1 на ВгСБ-Сефарозе 25 4 В. Через реактор проточного типа с иммобилизованным ферментным препаратом пропускают реакционную смесь, содержаХцую АМФ, ацетилфосфат, Мя и в+21качестве затравки незначительное ко личество АТФ. Выход АТФ после реакции составляет 97-98% от запускаемого количества АМФ.П р и м е р 1. Приготовление ферментного препарата.35100 г замороженной при - 40 С биомассы Е. со 11 МНЕизмельчают в ступке, заливают 300 мп 0,1 М КС 1 в 0,01 М трис-НС 1 рН 7,5 с 2 мМ Р- меркаптоэтанола, перемешивают при +4 С до однородной суспензии, приливают раствор лизоцима в буфере из расчета 1 мг лизоцима на 1 г биомассы) и перемешивают 1 О мин, Затем сус" . пензию озвучивают в ледяной бане на 45 ультразвуковом дезинтеграторе (18 кгц) сеансами по 1 мин с перерывами в 1 мин. Общее. время озвучивания 20 мин. Суспензию центрифугируют в течение 40 мин при 10000 об/мнн. Супернатант используют как грубый экстракт, осадок отбрасывают.Обработка экстракта стрептомицинсульфатом.К 375 мг грубого экстракта приливают по каплям при тщательном перемешивании 43 мл 30%-ного раствора стрептомицинсульфата в 0,01 М трис-НС 1, рН 7,5, содержащем 2 мМЯ -меркаптоэтанола, до конечной концентрациистрептомицинсульфата 3%. После этогосмесь перемешивают 20 мин. Затеи центрифугируют (14000 об/мин, 40 мнн).Осадок отбрасывают. Супернатант подвергают дальнейшей обработке (фракцияСС) .Фракционирование сульфатом аммония.К 380 мл фракции СС при тщательномперемешивании на холоду присыпают не"большими порциями тонко растертые кристаллы сухого сульфата аммония(179,36 г) до конечной концентрации70% насыщения по (%1) ЯО Затемраствор тщательно перемешивают 30 мини центрифугируют (10000 об/мин,30 мич). Супернатант отбрасывают. Оса"док суспендируют в минимальном объеме0,7 насыщенного раствора сульфата аммония в 0,01 м трис-НС 1 рН 7,5 + 2 м МР-меркаптоэтанол. Суспензию разбавляютв 2 раза с буфером и тщательно перемешивают 20 мин, затем центрифугируют(14000.об/мин, 30 мин). Осадок отбрасывают, а супернатант подтитровываютс 0,5 н КОН до рН 7,5. Полученный препарат (100 мл) разливают по 1 О мл вгерметичные полиэтиленовые Флаконы изамораживают при -40 С (фракция."0,70,37 СА"). В таком виде препарат хранится 6 месяцев без потери активности.П р и м е р 2, Использование комплексного ферментного препарата, содержащего аценилаткиназу и ацетокиназу для синтеза АТФ.1 О мп фракции "0,7-0,37 А" размора"живают на льду и нанЬсят на колонку ссефадексом С(2,6 см х 40), предварительно уравновешенную 0,1 М К-фосФатным буфером рН 7,8, содержащим0,5 н. КС 1 и 2 мМ ;.меркаптоэтанол.После нанесения образца в колонку подают этот же раствор со скоростью250 мл/ч. Оптическую платность выходящего из колонки раствора регистрируют с помощью проточного денситометра при длине волны 280 нм. Фракцию,содержащую белок, собирают отдельнои немедленно подвергают иммобилизациина ВгСФсефарозе,Иммобилизация ферментного препарата на ВгСИ-сефарозе 4 В.2 г сухой ВгСБ-сефарозы 4 В (фирмы"РЬагшас 1 а", Швеция) промывают настеклянном пористом фильтре 200 мл0,001 н, НС 1, затем 200 мл 0,1 М К-фосФата рН 7,8, содержащего О, 5 Н КС 1837066 Редактор О. Юркова Техред Л.Олийнык Корректор И. Иуска Заказ 6 В 64 Тираж 501 Подписно е ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101 и 2 м М -меркаптоэтанол, Отмытую ВгСИ-сефарозу переносят в чистый Фла кон вместимостью 15-20 мл. Туда.же приливают 7 мл обессоленного фермент- ного препарата, содержащего 30 мг5 белка. Смесь легко встряхивают 16 часона холоду (+5 С). После иммобилизации содержимое Флакона количественно переносят на стеклянный фильтр и промы вают на колбе Бунзена.100 мл 1 М КС 1 в .0,001 М трис-НС 1 рН 7.5 для снятия ковалентно несвязанных белков.Затем иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) встряхивают в течение 30 мин с 30 мл 1 М трис-НС 1 рН 7,5 для экранирования непрореагйрованных .групп сорбента.После этого ИФП отмывают на стеклянном пористом Фильтре 100 мл 0,01 М 20 трис-НС 1 рН 7,5, содержащего 2 мИ меркаптоэтанол, слегка отжимают, переносят в герметичный флакон с широким горлом и заливают 200 мл 0,01 И трис-, НС 1 рН 7,5, содержащего 2 мМ АТФ, 2 мМ 25 МяС 1 и 2 мМ,Р-меркаптоэтанол, В таком виде ИФП хранят при +4 С.оСинтез АТФСинтез АТФ проводят в термостатиру- емом реакторе проточного типа с иммо. - 30 бнлизованным ферментным препаратом (30 мг белка на 2 г ВгСН-сефарозы 4 В), содержащим 120 ед. ацетокиназы и 100 ед. акт аденилаткиназы. Реакционную смесь следующего состава: 20 мИ АМФ, .2 мМ АТФ, 80 мМ ацетилфосфат, 20 мИ МяС 1, 2 мМ/-меркаптоэтанол, 50 мИ трис-НС 1 рН 7,5, пропускают через колонку с ИФП, термостатируемую при 37 С,со скоростью 20 мл/ч. При этом глубинасинтеза АТФ составляет ые ниже 97,5Производительность такого реакторасоставляет 5 г АТФ в сутки (0,2 гАТФ/ч) при его объеме 2 мл.Производительность реактора с частично очищенным ферментным препаратом, содержащим ацетокиназу и аденилаткиназу. и производительность ре-,актора с высокоочищенными ферментами41 51 одинакова в пересчете на ко"личество единиц активности фермента,связанного с матрицей.преимуществами описываемого способа являются использование одного источника вместо двух источников фер. -ментов - биомассы Е. со 1 - т.е. упрощение способа; проведение вместомногостадийной (14 стадий) и тонкойочистки каждого из ферментов четырех.стадийного выделения и грубой очистки ферментов 1 исключение использования пищевого сырья - мьппц кролика;уменьшение расхода реагентов на очист-ку ферментов, не требуется сложноеаппаратурное оформление,1При использовании в широких масштабах синтеза АТФ на иммобилизованных ферментах, что является наиболее перспективным для получения АТФ, самой трудоемкой и дорогостоящей стадией является выделение ферментов. Поэтому использование вместо высокоочищенных ферментов из разных источников, грубоочищенного ферментного препарата из одного источника является экономически более перспективным.