Способ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот в биологическом материале

1 13322Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к липидологии, и может быть использовано для определения Фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК) в биологическом5 материале.Цель изобретения - ускорение способа за счет одновременной экстракции определяемых веществ и опрецеления их 10 содержания в одном образце.Способ осуществляют следующим образом.Экстракцию липидов из биологического материала проводят смесью эта нол-диэтиловый эфир в соотношении спирт:диэтиловый, эфир 1,0:1,0 (по объему), взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, при добавлении к образцу азотнокислого или 20 сернокислого кадмия в конечной концентрации 10 мМ при рН 8,0, Разделение фаз проводят путем добавления воды и диэтилового эфира в количестве 1,2 и 1,0 объемов соответственно; 25 таким образом, конечное соотношение вода:спирт:эфир равняется 2:1:2. Затем верхняя фаза отбирается.Вторым этапом является дополнительная экстракция водно-спиртовой 30 фазы пентаном, взятым в соотношении 2:1:2. Приливают пентан, интенсивно встряхивают смесь в течение 3 мин, дожидаются расслоения, верхнюю фазу отбирают и приливают к первому экстракту. Объединенные экстракты центрифугируют при 3000-5000 д 20 мин при этом происходит удаление воды из экстракта обычно в количестве 0,1-0,2 объема. Затем верхнюю Фазу 40 отбирают, приливают к ней по 0,1 объемной части спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха.Третьим этапом является Формирование тонкой пленки липидов на угольной 45 подложкеДля этого проводят растворение экстракта в небольшом количестве диэтилового эфира и наносят его каплями на отполированную угольную подложку, 50Последний этап включает в себя регистрацию рентгеновской Флуоресценции и расчет содержания фосфолипидов и СЖК по интенсивности рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответст венно с использованием предварительно построенной калибровочной кривой,Для отработки метода используют рентгеновский энергетический спектро 272метр "КЕЧЕХ", установленный на базе сканирующего электронного микроскопа "Н 1 асМ 8-500", Угольные подложки диаметром 6,5 мм и высотой 2- 3 мм изготавливаются из углеродных стержней, применяемых в электронной микроскопии для напыления, и не имеют собственных пиков характеристического излучения в рабочем диапазоне энергий. Рентгеновскую Флуоресценцию регистрируют при условиях: ускоряющее напряжение 20 кВ, расстояние между образцом и детектором - 10 мм, угол наклона образца - 30 , площадь регистрации 0,5 х 0,5 мм, ширина канала амплитудного" анализатора 10 эВ на канал, эффективное время регистрации 100 с, Единицей измерения служит величина 1, отношение числа импульсов характеристического излучения к фоновому в диапазонах 1,91-2,11 для фосфора и 3,03-3,23 для кадмия, Для построения калибровочной кривой исследуют смеси стеариновой кислоты с лецитином или кефалином в соотношении СЖК/ФЛ - 10, 20, 40 и 100 мол.с экстракцией и последующими манипуляциями описанным способом. Порог количественного определения равняется 5 нмоль, а оптимальный диапазон определения 25-200 нмоль,Способ может быть употреблен для оценки степени гидролиза Фосфолипидов фосфолипазами, Степень гидролиза (мол. ) легко оценивать по соотношению импульсов характеристического излучения кадмия по отношению к Фосфору.П р и м е р. Предлагаемый способ применяют для определения содержания фосфолипидов и СЖК в митохондриях печени белых крыс при активации собственной фосфолипазы. Для этого инкубируют изолированные митохондрии (8,75 мг белка) в изотоническом растворе КС 1 при рН 8,0 в присутствии 1 мМ СаС 7 общим обЪемом 2,5 мл в течение 60 мин, Через каждые 10 мин производят отбор в количестве 0,2 мл по 3 пробы на определяемую точку. Далее проводят операции по определению фосфолипидов и СЖК, С.этой целью каждую пробу, содержащую 0,7 мг белка митохондрий вводят в стеклянную пробирку объемом 5 мп с пластмассовой пробкой, где находятся 0,6 мл азотнокислого кадмия в концентрации 13,3 мМ, Затем добавляют 1 мп этило11,5 230 240 12 5,1 235 12 8,2 1 О 18 220 8,1 8,2 230 19 8,3 240 20 12,1 26 215 20 12,2 27,5 11,2 245 3 133222 вого спирта и 1 мл диэтилового эфира, закрывают пробкой и встряхивают в течение 5-10 мин, Далее добавляют1,2 мл воды и 1 мл эфира и дожидаются полного расслоения (1-3 мин), после чего отбирают верхнюю фазу в такую же пробирку. К оставшейся фазе приливают 2 мл пентана, закрывают пробкой и интенсивно встряхивают в течение 3-5 мин, дожидаются расслоения в течение 1 3 мин, затем отбирают верхнюю фазу и приливают к первому экстракту, Центри-,5 фугируют объединенный экстракт при 3000 д 20 мин. При этом образуется нижняя фаза (водно-спиртовая) в количестве 0,1-0,3 мл, Верхнюю фазу отбирают. и переносят в другую пробиРку. Добавляют по 0,3 мл спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха (20-40 мин), затем к получившемуся экстракту добавляют 0,3 мл эфира для растворения и с помощью микрошприца наносят экстракт на угольные подложки диаметром 6,5 мм, высушивая на вбздухе, и регистрируют рентгеновское излучение с помощью мнкроанализатора "КЛЕХ", Рассчитывают по калибровочной кривой содержание фосфолипидов и СЖК в пробах, Полученные результаты представлены в табл, 1,Фосфолипи- СЖК, нмолды, нмоль 74Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов приведена в табл, 2Формула изобретенияСпособ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот в биологическом материале путем экстрагирования проб органическими растворителями в присутствии солей двухвалентных металлов, высушивания экстракций для получения тонких пленок с последующим рентгеноспектральным анализом, о т л и ч а ю щ и й с я .тем, что, с целью ускорения способа, в качестве солей двухвалентных металлов используют азотнокислый или сернокислый кадмий в конечной концентрации 10 мМ при РН 8,0, экстракцию проводят смесью диэтиловый эфир: этиловый.спирт в объемном соотношении 1:1, взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют диэтиловый эфир и воду до достижения соотношения объемов диэтиловый эфир:втиловый спирт . вода 2:1:2, эфирную фазу удаляют, а к водно-спиртовой фазе дополнительно добавляют пентан в объемном соотношении 2: 1:2, отбирают верхнюю фазу, а фосфолипиды и свободные жирные кислоты определяют по интенсивности характеристического рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответственно. Степень гид- Средняя ролиза, мол.7. степеньгидролиза, мол.7е Экстракция лип я ли кст 0-12 танол-хлор месь спирт - эфир ров ание ентри акция пентаном й еэкстракция метаноллороформом е водно-спи 0-1 5-20 2 0 асслоение упари е-3 Приготовление про актеристи Регистрация ческого иэл 30 паривание экстракта орнои кис оло инкубация с и молибдато 20-25 ммония 2 лориметри Определение свободных жных кислот Времякубаци удалефаэы фолипи нмоль пределен олипидов бработкотой Средняястепеньгидролиэа оличества фо1332227 Продолжение табл. 2 экстракция смесью хлороформ-гептан с К удаление фосфолипидовсиликагелем 10 измерение радиоактивности % на сцинтилляционном счетчике 10 Итого 260-380 50-85 Составитель Н, ГуляеваРедактор А. Ворович Техред А.Кравчук Корректор А.Обручар Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР