Способ определения фосфолипидов

.А. Куци зиани СР 2,ельство33/48,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ(57) Изобретение относится к биохимии, предназначено для биохимическогоанализа фосфолипидов биохимическихпрепаратов и биологических объектов.Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Для этого к пробе, содержащей фосфолипиды, добавляютчетыреххлористый углерод. Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутномолибденовым реактивом, разведеннымэтиловым спиртом не менее чем вдвое,краситель берут в соотношении 1-2 мпна 10-100 мкг фосфолипидов. 3 табл.Изобретение относится к биохимиии физико-химической биологии и можетбыть использовано при биохимическоманализе фосфолипидов биохимическихпрепаратов и биологических объектов.Цель изобретения - повьппение чувствительности способа за счет использования в качестве красителя ртутномолибденового реактива, разбавленного 10этиловым спиртом,Способ осуществляют следующим образом.К пробе, содержащий фосфолипиды,добавляют четыреххлористый углерод. 15Затем раствор фосфолипидов обрабатывают ртутно-молибденовым реактивом,разведенным этиловым спиртом не менеечем вдвое.Реактив готовят следующим образом,Раствор А - это 16 г молибдатааммония в 120 мл дистиллированнойводы; раствор Б - к 10 мл ртути прибавляют 40 мл НС 1 и 80 мл раствора А. 25В дальнейшем к остатку раствора Адобавляют 200 мл концентрированнойсерной кислоты и полностью раствор Б.При инкубации указанного реактива сэтиловым спиртом получают темно-синий раствор. При изменении времениинкубации изменяется окраска комплекса реактив - фосфолипид, Поэтомупри количественном определении фосфолипидов необходимо строго соблюдать З 5время инкубации, при этом не имеетзначения инкубируют смесь 10,16 или24 ч. Важно, чтобы все опыты проводились на реактиве, полученном приопределенном времени инкубации. 40П р и м е р 1, Липиды из кровикрыс экстрагируют 20-кратным объемомсмеси хлороформ-метанол 2:1, два разасмесью 1:1 и затем осадок заливаютэтой же смесью 1;1 и оставляют на 45ночь. На следующий день экстракциюлипидов проводят еще дважды смесьюхлороформ-метанол 2:1. Объединенные липидные экстракты отмывают от водорастворимых примесей охлажденным раствором О,ЗН ИаС 1 добавлением с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не более 50 . спирта (чтобы он не извлекал фосфолипиды).После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывают. Пленку, образующуюся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенной и водно-спиртовой) растворяют добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают досуха под вакуумом при комнатной температуре, Общее количество липидов определяют весовым методом, сухой остаток растворяют в органическом растворителе СС из расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось до 100 мкг липидов.Процесс выделения липидов и определения в них количества фосфолипидов проводят при комнатной температуре.К липидам, растворенным в 5 мл СС 11, добавляют 1 мл красителя и инкубируют 1 О мин на водяной бане при 60 С. Органическая фаза принимает голубую окраску. После разделения фаз к органической фазе прибавляют 60 - ную серную кислоту и инкубируют 10 мин на водяной бане при 60 С для устранения мутности раствора (берется 60 - ная серная кислота потому, что при низких концентрациях кислоты мутность органической фазы не исчезает, а 60 и вьппе уже дают прозрачные растворы комплекса в органической фазе). Разделяют фазы и через 30 мин в органической фазе определяют оптическую плотность комплекса краситель-фосфолипид при 670 нм, По стандартной кривой зависимости оптической плотности от концентрации фосфолипида определяют концентрацию фосфолипида в крови крыс.Продолжительность процесса опреде ления 55-60 мин, чувствительность 10 мкг.П р и м е р 2. Проводят определение в стандартных растворах фосфолипидов так, как описано в примере 1, В табл. 1 представлена зависимость оптической. плотности от концентрации фосфатидилхолина и смеси фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, а в табл.2 - от концентрации фосфолипидов при разных объемах красителя.П р и м е р 3. Проводят определение фосфолипидов в разных биологических объектах, Данные представлены в табл, 3.Эти объекты исследуются и поэтому в табл, 1 приведены только данные о количестве фосфолипидов в них. Хо1332228 тя аналогичным образом можно опреде- ля, разделения фаз и последующего лить концентрацию фосфолипидов и для спектрофотометрирования органической других клеток и биологических мемб- среды, о т л и ч а ю щ и й с я тем, ран5что с целью повышения чувствитель,ности способа, в качестве красителя Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я используют ртутно-молибдейовый реактив, разбавленный этиловым спиртомСпособ определения фосфолипидов не менее чем вдвое, причем краситель путем растворения пробы в четыреххло берут в соотношении 1-2 мл на 10- ристом углероде, добавления красите мкг фосфолипидов.Таблица 1 Фосфолипиды Оптическая плотность при концентрации, мкг 5 10 20 40 60 80 100 200 400 Фосфатидилхолин 0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23 Фосфатидилхолин + фос- фатидилсерин 0,0 0,02 0,04 0,08 0,13 0,17 0,20 0,21 0,22 Таблица 2 1 О 20 40 60 Оптическая плотность при концентрации фосфолипидов, мкг Объем красителя,мл5 80 100 200 400 600 800,0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23 0,24 0,24 0,0 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,22 0,23 0,24 0,24 0,08 0,08 0,08 0,08 0,10 0,10 0,25 0,34 0,50 0,70 0,80 0,08 0,08 0,08 0,08 0,10 0,10 0,25 0,34 0,50 0,70 0,80 Т а б л и ц а 3 Продо охондрии печекрыс 60 Лизосомы печени0 крыс 234 ф 4 Эритроциты кровичеловека 12+7 Азрегд 3.цз пхни 015 Лимфоциты селезенки крыс 4 Азрегд 1 из Сегцез каз 3826/40 Тираж 776 Подписное роизв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная