5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью

(73) Институт моле сугстратов бладающихСущность афталин- "-й Н(наф- Я - метил, тил, тлеток- енэилокси- оответству- линсульфаакдении в йг 33-36улярной г(54) 5-АРГИНИЛАМ КОКСИЭТИЛ)СУЛ Ь СТВЕ СУБСТРАТО ФЕРМЕНТОВ, ОБ ПЕПТИДАЗНОЙ А 1-(АЛ- КАЧЕЛИЗА ИНОИНОНАФ ФОНАМИ В ДЛЯ АР ЛАДАЮЩ ТИВНОСТ А-ЛНАИХ АМЮ лморфолин, ния является о расширяет определения то ас ферменстьюЦел тов с аминоп ь изобретения а субстратов д ои активно- расширение ассоропределения фер 1 тидазн мент о4 ти- ри- тся 2 ЙНСН 2 С Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам Изобретение относится к области органической химии, конкретно к химии замещенных аминонафталинсульфонамидов, применяемых, например, в качестве субстратов при хроматографическом анализе ферментов,Изобретение может быть использовано в химической промышленности для получения замещенных 5-аминонафталин-сульфамидов и в биохимии при анализе аминопептидаз,Известны 5-аргиниламинонафталин- сульфонамиды с углеводородными радикалами в сульфпнамидной группе, применяемые в качестве субстратов для определения ферментов, обладающих аминопептидазной активностью,Недостатком известных соединений является их малый ассортимент, в то время как для дифференцированного определения индивидуальных ферментов с аминопеп дазной активностью, находящихся в п родных источниках в смеси, требуе большое разнообразие субстратов,Известен как субстрат для ферментов с аминопептидазной активностью 5-арганиЯ, 2000297 С(57) Использование: в качестве для АИСА-анализа ферментов, о амиопептидной активнос 1 ью, изобретения; 5-аргинил(амино)-н (алко.си)атилсуп л о-, л талин)50; М(Н)СН 2 СН 2-О-В, где этил, пропил, изопропил, изобу сиэтип, этоксиэтил, Реагент 1: б карбонил-аргинил, Реагент 2; с ющий бромгидрат аминонафта мид, Условия реакции: при охл ДМФА, 4 табл. глинонафталин-сульфон" достатком данного соедине что оно лишь незначительн сортимент субстратов для ментов, обладающих аминопептидазной активностью.Цель достигается тем, что в качестве субстратов для определения ферментов, обладающих аминопептидазной активностью, предлокены 5-аргиниламинонафталин- (алкоксиэтил)-сульфонамиды общей формугде К - тлетил, атил, поопил, изопропил, изобутил, ме 1 оксиэтил, этоксиэтил.1 р 1 воздействии определяемых фер,",егав 3 д сллесь предпоженых новых суб р, ГРВ ссрес. с)дИГ ОТцЕПЛЕНИЕ дрГИНИЛЭ С )с/."д:с. ВВием 5-дллинондфтдлин-(длкок- эЭ И ,;Ус)ЬФС)НЕ)МИДОВ. КОТОРЫЕ, РаЗЛИЧД/ П с С:);-. С;И 1 Е Л Я М И С С у Л Ь ф 0 и д Г 1 И Д Н 0 И ,Г с ОГ)ЛДДДОТ СХОДНЫМИ СПЕКТРДЛЬНЫМИ;., л:Г)3 СТ ИКЗК 11, 310 РДЗЛИЧНО 1 ХООМдТОГ- г Ос ГсолнижНОСТЬК, ЧтО ПОЗВОПЯЕт / с;,", ЬРГс,Нсрг)вдНЕО ОПрРДЕПятЬ, ИС, Я:;3/ссстогРГ)флсескле меОДы, Тем с" Дс.;, с, с СЕсс с 3.сЯ ВС):М/3 КНОтЬ КоличЕСГ ПЕ,;сС 0 Рс ГвлсЛТЬ ГРДУКГЫ Г;СсС)ТЕОПИЗД.,) 33, с с/ ст Ос.я пи су.Их сОР,С, СС; С С СС.С 3и ) 3)С:1Лсп Г рИЕЛЛМИ,есс с: .лс ллинссс 1 сддзы е)ецестВдС1 О С33 И СС Р С ) / 1 3 У КП С Я Д 0 С 31 О Г) 0 Д Н Ы Х 3) 1)с с 3 Н : Е)ЛНОдфт;3,331 сулвфдЛдд. ПОС/ сД 1 ИИ 061 дружи Е) От Х рОМ ЭТО 1)дфИРГКИГ р и сл е р 1. Синтез 5-(кдрбобензокси)дминонафтэлин(димл типен)супьфонэмида (и ромекуточ ое),5,04 г (0,04 моль) 5-(кдрбобензокси)-дминоафтд/Ин-сульфохлорслда при перемешивэнии нэ магнитной мешалке рдгтворяютв 200 мл мегднопд, добдвпяют 3,7 мп (0,04моль) триэгипдминд и 1,72 ллл (0,04 моль)эзиридинд (этиленимина) Через 30 мин начинается выпддение белсго осадка. Перемешивдние продолжают в тс:.чение 2 ч, Зэтеглосэдок отфильтровьвдют нд Вдкуумномфильтре, промывают метднолом, сушат нэдКОН, Получают 5,01 г бесцветных кристаллов, с т,пл. 107"С, выход 92,2 " , При использовании в качестве растворителя этэнолдвыход 91 ,П р и м е р 2. Синтез 5-(кэрбобензокси)аминондфтдлин-(метоксиэтил)сульфонэмида рдскрытием азиридинового цикла(промежуточное)5 г 5-(кдрбобензокси)-аминонафтапин 1-(диметипен)сульфдмида и 1 мл эцетэтаВГз в 150 мп абсолютного метанола кипятятв плоскодонной колбе с обратным холодильником. Через час охпджддют до комнатнойтемпературы, Добавляют воду Ло появления 5 1 О 15 20 25 30 35 40 50 55 белой суспензии и оставляют стоять нд 1 чпри температуре 10"С, Выпдвший оса 10 котфильтровывэют, промываот на фильтреводой, сушат нэд КОН. Получдют 5,01 г бесцветных кристдллов с т,пп 144 С,вьход92,2,Аналогичным способом были получены5-(кдрбобенэокс 1) дминондфтэпин(элкокСИЭтИЛ)СУПЬфОНЭМИДЬс СООтпвтстВЕНО ИЗЭТИЛОВОГО, П-ПРОПИЛОВОГО, 1-гРОПИЛОВОГО, 1 бутипового спиртов (см. табл 1)П р и м Р р 3. Син) ез 5 (дрбобензокси)аМИНОНафтдЛИ 1- 1-(3,6-дс)сдЕПТИЛ)супвфондмидэ рдскрытием дзириднопогс) цикла(промежуточное).4 г 5 (кдрбобеезокси)ли 0311:ли(дИМЕтИПЕН)СупЬфОНЛМИДЛ Г 15 с 0 ЛП лвтПЦЕЛПОЗОПЬГа 3 ДГРРЕ)ДК)т В ЛОСЕ.",ДО 13 ойколбе с обрдгным хоподилы 3 колл и киплщеи Водяной бане. 1 Мп дцегдгд ВГ Дс)бдпляют В рдзогрегуо смесь через 20 /ли смесьОХЛВЖДЛЮ), ДобдВЛяс 01 11). 0. 1 с/Ьс Дордсслоения смеси, Верхи 030 фдзу с/иедОт,масло рдстпорпюг В Горячел летаОпе добавляют 2 г дктивировд 33 ог) угля, перс:.Ме.ВИВДЮт, У ОЛЬ фИЛЬтРУЮт, 1 Е Гоп сОТсс)уцарИВЛОТ дОбавляОГ НЕСКОПЬК КПЕПЬ Юдьс до появления белои суси.нзии и с)стдвляЮт Стс.ять при 10"С, В,п/1313.3)1 Осддпкотфильтровывают, суцат ЛД КОН, Полу дЮт 4,22 Г бЕСцВЕтнс К)С;3/)/)с) Г. с ГП,64" С. ВыхоЛ 66"-,4,Анэлогичным способпм бьп сОпучен 5(кдрбобензокси)-дминондфтдп ин-(3,6-диоксэоктил)сульфонэмид иэ этипцеллозопьва.Г 1 р и м е р 4. Г 1 олучение брок 1 лдрэтд5-элинондфталин-(мегокси )тц/)су/ьфоедмида.7,04 г (0,016 моль) 5-(к;)рбобезокси)аминонафтдлин-(метоксиэил)суп ьфонамида перемешивдкт нд лланитной мешалке с 17 мп (0,051 моль НВ) 3 ЕЛ рдствораНВГ В уксуснои кислоте, "1 е)РЗ 2 ч вь 3 Г 1/33)13)ИЙосадок трижды промывают эфиром, огфипьтровывают, промьвдют эфролл нд Фильтре,сушат ндд КОН.Получдют 6,05 г продукта, выход 98,6%.Аналогичным обрдзогл снлмдют карбобензоксильную защиту у всех остальныхполученных производных 5-аминондфтэлин-(а/коксиэтип)сульфоедглидов с получением бромгидрдтов соотвРтствуоцихаминонафтдлинсульфондмидов (тэбп.4).П р и м е р 5, Получение 5-дргинилдминонэфтдпин-сульфондмидов,Ндвеску сухого кдрбобенэокси-дргинина (7-дргиние) (40 ммоль) растворяют приосторожном нагревдии В 50 мл безводногодимРтил 1)ормдмидд В трехГОГ)лои колбе сН магнитной мешалкой, низкотемпературным термометром и хлоркальциевой трубкой охлаждают до -30 С 30 мл ДМФА и при перемешивании приливают в один прием 4 мл тионилхлорида, Температура быстро поднимается до -15 С. Убирают охлаждение и дают нагреться до комнатной температуры, снова охлаждают до -30 С и вливают в один прием предварительно охлажденный ранее 2.-аргинин, перемешивают в течение часа при 0"С, Навеску бромгидрата соответствующего аминонафтдлинсульфамида (20 ммоль) растворяют в ДМФА, добавляют 120 ммоль пиридина, полученный раствор вводят в реакционную смесь при охлаждении ниже -5 С, продолжают перемешивдние 2 ч при охлаждении и затем еще несколько часов при комнатной температуре. За ходом реакции наблюдают при помощи ТСХ После исчезновения нэ хромдтогрдмме пятна исходного аминонафталин сульфондмида (АНСА) при перел 1 ешивании добавляют 250 мл этилацетата, д затем 300 мл гексднд, оставляют раствор стоя гь при 4"С до тех пор, пока он не просветлеет. Раствор сливают, остаток промывают 3 рдзд смегью этилацетат гексан, растворяют в 0,5 л воды и четырежды зкстрдгируют бутанолом(40-40-40-40 мл), водную Фазу отбрасывают, бутднольный слой промывают водой, 4 раза по 10 мл 5 МдНСОз, снова водой, упдривдют в вакууме досуха, сушат в вдкууме. К остатку добавляют 50 мл 3 М раствора НВг в уксусной кислоте, колбу закрывают хлоркальциевой трубкой и перемешивают, наблюдая за снятием защитной группы с помощью ТСХ. По завершении реакции в колбу при интенсивном перемешивании вливают 200 мл сухого эфира, дают осесть осадку, жидкость сливают. осадок промывают эфиром еще трижды, растворяют в 500 мл воды. экстрагируют этилацетатом, нейтрализуют йаОН до рН 8,4, затем четырежды экстрагируют бутанолом по 30 мл, упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в спирте 20 мл, добавляют по 3 г активированного угля и инфузорной земли, перемешивают, фильтруют и упаривают досуха.Продукт получают с выходом 12-22 оиз расчета на вступивший в реакцию АНСА, Полученный продукт хорошо растворяется в полярных растворителях (воде, спирте) и плохо в неполярных (этилацетате, гексане).Таким образом были получены субстраты:аргинил-аминонафталин-(метоксиэ тил)сульфамид,5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аргинил-аминонафталин-(этонсиэтилсуп ьфдмид,аргинил-аминонафталин-пропиоксиэтил)суп ьфдмид,дргинил-аминонафталин.изопропиоксизтип)сульфамид,аргинил-аминонафтдлин-(изобутоксиэтил)сульфдмид,аргинил-аминонафталин-(диоксагептил)сул ьфамид,дргинил-аминонафталин-диоксдоктил) луп ьфамид(см. табл.2 - 3),П р и м е р 6. Составляют эквимольнуюсмесь семи Агц-АНСА-субстратов В 1 млраствора содержится по 2 о.е. (Лнм)каждого из субстрдтов, 0,166 мл трис-НС,0,2 М буфера рН - 7,2. В пробирку типаЕррепдог 1 помещдют 500 мкл смеги, добавляютт 30 л 1 кл раствора лейциндминопептидазы,перемешивают, выдерживдют до исчезновения голубой фпюлоопцан иф чри 25"С,добдвляют 500 мнл экстрагента этилацетат- гексэн (в соотношении 2:1), перемешивают и рдздепяют фазы путем центрифугировднич, Лз верхней фазы отбирают 10 мкл,высушивдют на воздухе. Остаток растворяют в 30 л 1 кл ацетонитрила, отбирают аликвоту20 мкл и детектируют продукты протеолизас помощью ВЭЖХ. Все продукты протеолиза имели л 1 аксил 1 умы и минимумы поглощения, а тдк же ореля удержания в колонке,соответствующие дднным, представленнымв табл.2Таким образом. продукты протеолиза,поученные при воздействии лейцинаминопептиддзы на смесь субстратов, представленных новыми соединениями удаетсядифференцировать методами ВЗЖХ,Формула изобретения 5-Аргиниламинондфталин-(длкоксиэтил)сульфондмиды общеи формулы Ро "О-В где й - метил, атил, пропил, изопропил, изобутил, метоксиэтил, этоксиэтил,в качестве субстратов для АНСА-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью.102000297Продолжение табл, 2Колонка СОС Сепарон ЯОХ 18 детекция по Уф 254 нм, Р=85 Ваг элюэнт 35 ацетонитрили 0,05 М ацетат аммония, скорость элюции 0,56 мл/минТаблицаЗ- Выход дан на вступивший в реакцию АНСА Табл ица 4 ЯМР протонов 3,10 (2 Н) 3,15 (ЗН) 3,18 (ЗН) 3,32 (2 Н)5,27 (2 Н) 7,49 (5 Н) 7,60-7,84 (ЗН)8,10 (1 Н) 8,22 (1 Н) 8,42 (1 Н)8, 58 Д Н 9, 83 1 Н 1,04 (ЗН) Э,1 (1 Н) 3,29 (2 Н) 3,34 (2 Н) 5,32 (2 Н) 7,30-7,61 (5 Н) 7,61-7,91 (ЗН 8,12 (1 Н) 8,24 (1 Н) 8,41 (1 Н)858 (1 Н) 8,86 (1 Н) 0,86 (ЗН) 1,44 (2 Н) 3,12 (2 Н) 3,21 (2 Н) 3,36 (2 Н) 6,32 (2 Н) 7,52 (5 Н) 7,76 (ЗН) 8,12 (1 Н) 8,26 (1 Н) 8,42 (1 Н) 8,61 (1 Н) 988 1 Н 1.02 (бН) 3,09 (2 Н) 3.34 (2 Н)3,25-3,60 (1 Н) 5,32 (2 Н) 7,38-7,60 (5 Н)7,60 - 7,91 (ЭН) 8,10 (1 Н) 8,25 (1 Н)8,42 1 Н 8,58 1 Н 9,87 (1 Н0 91 (6 Н) 1,73 (1 Н) 3.10 (2 Н) 3,16 (2 Н) 41 (2 Н) 7,39-7,63 (5 Н) 7,63-7,94 (ЭН) 15 (1 Н) 8,27 (1 Н) 8,46 (1 Н) 861 (1 Н) 89 1 Н 3,12 (2 Н) 3,30 (ЗН) 3,32-3,60 (6 Н) 5,32 (2 Н) 7,38 - 7,65 (5 Н) 8,12 (1 Н) 7,65 - 7,91 (ЗН) 8,24 (1 Н) 8,41 (1 Н) 8,57 1 Н 9,86 1 Н 5-(карбобензокси) аминонафталин- сульфамиды; спектры ЯМР протонов14 13 2000297 Продолжение табл 4 Составитель А.НедоспасовТехред М.Моргентал Корректор М,Ткач Редактор Т,Пилипенко Заказ 3063 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж. Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101