Способ йодирования клеток

(54)(57) СПОСОБ ЙОДИРОВАНИЯ КЛЕТОК путем инкубации их в присутствии радиойода и хлорамина Т, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных лимфоидных клеток, инкубацию клеток в концентрации (0,5-3,0)х 108 Кл/мл осуществляют с радиойодом в соотношении (2-6)х 10 Кл/мКи, а с хлорами 8ном Т в соотношении (0,25-1,70)х х 10 Кл/мкг при концентрации хлорамина Т менее 200 мкг/мл.72 1т.е, к уменьшению жизнеспособностипройодированных лимфоцитов,С целью получения радиойодированных лимфоцитов с предельно высокими показателями жизнеспособности (падение жизнеспособности врезультате реакции менее 37) дляиспользования в реакциях клеточного иммунитета ин-виво и ин-витроприменяют реакционное соотношениеконцентраций клеток к радиойоду,равное 4 х 10 Кл/мКп, и соотношение3концентраций клеток к хлораминуТ, равное 1,бх 10 Кл/мкг.6Для достижения максимальной чувствительности в исследованиях с применением полученных меченых лимфоцитов ин-вино и ин-внтро путем предельно высоко эффективного йодирования и высокого насыщения клетокйодом (при условии падения жизнеспособности клеток в результатереакции не более чем на 107) необходимо использовать иммунологическиактивированные лимфоциты при отношении их концентрации к концентрацииклеток, к концентрации хлорамина .Т равном 0,56 х 106 Кл/мкг.П р и м е р 1. Йодирование лимфоцитов с максимальным сохранениемих жизнеспособности.В реакционную пробирку последовательно вносят 03 мл клеточнойсуспенэии лимфоцитов в растворе Хенкса с реакционной концентрацией1,9 х 108 Кл/мл, 0,01 мл радиойода -125 .(1/2 мКи)0,1 мл хлорамина Тс реакционной концентрацией 116 мкг/мл,Инкубацию выполняют в течение30 с при умеренном встряхивании.,Реакцию останавливают добавлением5 мл холодного раствора Хенкса+4 С и отмывают их 3 раза тем жераствором от непрореагировавшегорадиойода центрифугированием клетокв течение 10 мин при 800 об/мин(120 о), ЭФфективность йодированияпри этом не более 207 а жизнеспособность клеток снижается не болеечем на 27П р и м е р 2. Йодирование клеток с максимальной эффективностьюреакции мечения и с максимальнымнасыщением клеток радиойодом,Заблаговременно выполняют стандартную активацию лимфоцитов иммунологическим методом. Например, вводят за 2 недели до йодировання подопытным животным (мышам) по бх 109 20 25 30 35 40 45. 10842Изобретение относится к прикладной иммунологии, преимущественнок получению меченых йодированныхклеток, и может быть использованопри проведении иммунологическихисследований.Известен способ йодирования белковых структур клеточной стенкипосредством хлораминового йодирования белков Г 13.0Однако этот способ не позволяетполучить меченые лимфоидные клеткис высокой степенью жизнеспособности(выход жизнеспособных клеток 257).Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных лимфоид.ных клеток.Укаэанная цель достигается тем,что согласно способу йодированияклеток путем инкубации клеток в присутствии радиойода и хлорамина Т,отличительной особенностью являетсято, что проводят инкубацию клетокв концентрации (8,5-3,0)х 10 Кл/млс радиойодом в соотношении (2-6)хх 10 Кл/мКи, а с хлорамином Т в соотношении (0,25-1,0)х 106 Кл/мкгпри концентрации хлорамина Т менее200 мкг/мл.Способ выполняется следующимобразом.Мечение выполняют при реакционном соотношении концентраций кле-ток к хлорамину Т, равном (0,25-1,7)хх 10 Кл/мкг, и при реакционном6соотношении концентраций клетокк радиойоду, равном (2-6)х 10 пКл/мКипричем при соблюдении указанных соотношений реакционная концентрация клеток должна находиться в диапазоне(05-3)х 10 Кл/мл, а реакционная кон 8центрация хлорамина Т не должна,превьппать 200 мкг/мп, При этом насыщение лимйоцитов атомами йода подчиняется формулеХ=-0,27+1,24 У при 11 +0,9 и .Р ( 0,01 п (11где Х - радионасыщенность лимфоцитов,выраженная в единицах (миллионы атомов йода/клетка;У - соотношение количество йода -50125 в мкюри в реакционной смеси/количество клеток, выраженное в сотняхмиллионов/мп реакционной смеси.Формула (1) позволяет заранеерассчитать радионасыщенность лимфоци.55тов в результате реакции. Известно,что чрезмерное радионасыщение ведетк деградации меченого соединения,Таблица Концентрация хлорамина Т, мкг/мл Жизнеспособность при времени инкубации,с 120 60 600 1800 3,13 45,84 14,07 77,34 36,35 88,09 65,9 4000 69,33 86,73 13, 18 2000 94,09 1000 95,04 57,2 90,69 78,94 500 78,7 94,07 90,7 96,69 200 П р и м е ч а н и е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале инкубации принимают за 1003. 3 1084 микробных тел коклюшной вакцины. Этот адьювант и неспецифический модулятор иммунологической реактивности лимфоцитов приводит к существенному увеличению количества бел 5 .ковых. рецепторов на поверхности лим-, фоцита. В день йодирования выделяют иммунологически активированные лимфо циты и готовят клеточную суспензию в растворе Хенкса. 1 ОВ реакционную пробирку последова-. тельно вносят 0,3 мл клеточной суспензии лимфоцитов в растворе Хенкса с концентрацией 1, 12 х 10 Кл/мл8 0,01 мл раствора йодистого натрия 1/2 мКи 0,1 мл раствора хлорамина Т с реакционной концентрацией 200 мкг/мл. Инкубацию проводят 30 с при умеренном встряхивании и далее останавливают добавлением 5 мл раствора Хенкса +4 оС. Клетки отмывают от непрореагировавшего радиойода 3 раза раствором Хенкса и центрифугированием в течение 10 мин при 800 об/мин (120 ф). Эффективность йодирования для активированных лимфоцитов в этих условиях составляет 50- 653, а неактивированных лимфоцитов 40-502. Жиэнеспособность пройодированных клеток более 90730В табл, 1 представлены данные по влиянию времени инкубации лимфоцитов с хлорамином Т на их жизнеспособностьвыраженную в единицах число живых клеток35в табл.2- общее число клеток " фДанные по влиянию времени инкубации и концентрации лимфоидньи клеток на их жизнеспособность 272 4в процессе инкубации с хлорамином- Т; в табл. 3 - эффективность йодирования 1 лймфоидных клеток хлораминовым методом и их жизнеспособность по"окончании реакции.Жизнеспособность лимфоцитов падает при инкубации с возрастающими концентрациями хлорамина Т(табл.1). Динамика утраты жизнеспособности клетками становится круче при увеличении концентрации клеток до Зх 10 Кл/мл при стандартной конацентрации хлорамина Т (табл.2),Полученные данные впервые доказывают, что хлораминовое йодирование позволяет при точно определенных условиях получить жизнеспособные лимфоциты, меченые йодом с высокой эффективностью. Жизнеспособность лимфоцитов оценивают во всех случаях общепринятым способом по исключению красителя.Исходя из результатов исследований выполнена математическая оптимизация хлораминового йодирования лимфоцнтов путем линейной аппроксимации при следующих ограничениях: все зависимости представлены плоскостью, а не криволинейной поверхностью условия экстремума определяют только в области, ограниченной исследованными значениями реакционньм концентраций лимфоцитов хлорамина Т, радиойода и времени реакции.Таким образом, способ позволяет повысить вьмрд жизнеспособных меченых лимфоидных клеток более чем в 3 раза при повышении эффективности йодирования клеток более, чем в 2 раза.1084272 Таблица 2 Жизнеспособность при времени инкубации,С Концентрация хлорамина Т,мкгмл Концентрация клеток кг/мп.10240 360 600 1800 30 120 200 20 87,7 90,7 500 12,5 55,36 90,9.97,75 95,83 93,54 90, 1 65,67 П р и м е ч а н и е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в началеинкубации принимали за 1003; каждое цифровоезначение представлено средним из трехэкспериментов. Таблица 3 Время реакции, с Параметры реакциийодирования 30 120 15 600 Эффективность,7. 4,8 Жизнеспособность,й 99 Эффективность,% Жизнеспособность,Х 98,2 91,4 Эффективность,Х 37,85 34,85 Жизнеспособность,7. 97,78 90,6 25,25 29, 05 78,89 25,8 30 Эффективность,Х Жизнеспособность,Ж 99,6 87,73 54,33 48, 17 47,85 Эффективность,Е 89,3 Жизнеспособность,7 96,1 90,1 42,4 79,9 43,69 45,66 71,55 27,14 ЭфФективность,7. 42,39 Жизнеспособность,7 87,84 96,43 92,57 97,65 94,07 98,4 96,390,78 94 07 79,4 72,43 65,96 87, 16 84,55 78,94Вносимаяактивность1800 3600 Эффективность,З 6,55 7, 1 108 80 0,5 Жизнеспособность,й 85 82. Эффективность, Й 7,5 2 х 10 Жизнеспособность,З 84 Эффективность,Ж 29,95 28,92 2,8 х 10 150 0,5 Жизнеспособность,З 27,5 Эффективность,З 2 б 4 х 10 200 Жизнеспособностью 73 33 65,56 Эффективность,й 46,65 1, 12 х 10 49,7 200 0,5 70 840, 7 1, 9 х 10 200Жизнеспособность лимфоидных клеток в началейодирования принимали за 1007, каждое цифровое значение представлено средним значениемиз трех. экспериментов.,Примечание: Составитель П. БонарцевРедактоР Т. Веселова ТехРед Т.фанта КоРРектоР А,ТЯско Заказ 1919/18 Тираж 410 . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и.открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Параметры реакции,йодированияЖизнеспособность 3 75Эффективность 3Жизнеспособность,й Концентрацияклеток,