Способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы

, с присоединением заявки Йо(23) ПриоритетОпубликовано 150333. Бюллетень Мо 10 Р 1 М К зС 12 й 1/00 //С 12 ч 1/06 Государстяенный комитет СССР ио делам изобретений и открытийДата опубликования описания 15,03.83 Э.Г. Тутова, Э.В. Ивашкевич, Ю.Н. Тимонькннк.Р.С. Сабрекова, М.П. Вишникина, О.Е. Григорьянци Т.Э. Фруман3Ордена Трудового Красного Знамени институттепло-,и массообмена им. А.В. Лыкова:АН Белорусской ССР-" .:д":."-":р,(У 2) Авторы изобретений(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЖИЗНЕСПОСОБНЬК КЛЕТОК МИКРОБНОЙ БИОМАССЫТ= ( а+Ьи Ф 10 ф,Изобретение относится к микробиологической промьааленности, в частности к способам определения концентрации жизнеспособных клеток микроорганизмов.Известен способ определения концентрации жизнеспособных клеток путем рассева на питательные среды1).Ближайшим к изобретению техни.ческим решением по технической сущ,ности и достигаемому эффекту явля" ется способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы в процессе культивирования микрооргайиэмОВ на питательной среде Я.Недостатком известного способа является его продолжительность (1- 14 суток) и низкая точность анализа (не менее +30).Цель изобретения - ускорение спо,соба и повьаяение его. точности.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации жизнеспособных клеток мнк робиой биомассы в процессе культивни рования микроорганизмов на питатель" ной среде измеряют вязкость полученной биомассы при температуре культи вирования микроорганизмов, а концентрацию жизнеспособных клеток определяют по формуле 5где Т - концентрация жизнеспособных клеток, мг,М - кинематическая вязкость10 . биомассы, сст,а,Ь - эмпирические коэффициенты,определяемые природой биомассы,Прн этом перед измерением вязкости биоМассу фильтруют.Сущность предлагаемого способа определения концентрациИ жизнеспособныхклеток состоит в том, что для рядамикробных культур (спорообразующаякультура Вас 11 цв депдго 1 щ цв ВассИцгп 9 елвв, вегетативная культуракпго 1 ца р,1 вце) экспериментальноустановлена взаимосвязь межцу вязкостью биомассы и количеством жизнеспособных клеток в единице объемаОд" г. )с 980,7(2) где" время, с;д - ускорение силы тяжести:981 см/сК - постоянная вискозиметра.Расчет среднего значения вязкости исследуемой жидкости производят на основании 5"7 измерений .Параллельно измерению вязкости проводят микробиологический анализ образца исследуемой жидкости с целью определения титра (кл/мп) по стандартной методике методом последовательных разведений с высевом на твердую питательную среду.В результате статистической обработ ки экспериментальных данных получа" ют аналитическую зависимость титра исследуемой биомассы от вязкости (1).На чертеже приведена зависимость титра исследуемой биомассы от вязкости М - кинематическая вязкость бомассы, сСт;а,Ь- эмпирические коэффициенты,определяемые природой биомассы.Проводят измерение вязкости биомассы капиллярным вискбзиметром,диаметр которого выбирают с учетомприроды исследуемой жидкости. Приналичии в жидкости остатков питательных сред жидкости фильтруют через фильтр с размером ячеек, не превышающим диаметр капилляра вискоэиМетра, во избежание засорения капилляра вискозиметра. Заполненный жидкостью вискоэиметр термостатируютв устройстве, обеспечивающем визуальное наблюдение истечения жидкости через капилляр при температуре не выше температуры культиви"рования биомассы (28-ЗОфС) и через10-15 мин проводят измерение времени истечения жидкости через капиллярпри помощи секундомера. Расчет вязкости производят по Формуле (Паспорт к вискознметру ВПЖ)",Прямая линия, построенная на основании этой зависимости, является калибровочным графиком для определения титра биомассы (чертеж),П р и м е р 1. В лабораторных условиях измеряют зависимость вязкости от концентрации жизнеспособных клеток (титра,) культуральной жидкости Вас(11 цн ФЬцг 1 пд)епн)н штамм 5072 и суспензии клеток того же штамма. Опыты проводят на капиллярном вискозиметре ВПЖ(К=0,03033) при постоянной температуре 20 ф С с диаметром капилляра 0,86.Необходимости в фильтровании жидкости нет. Заполненный жидкостью вискозиметр помещают в термостатирунщееустройство, обеспечивающее визуальное наблюдение истечения жидкостичерез капилляр, выдерживают 15 мини проводят измерение времени истече"ния жидкости через капилляр вискозиметра, Затем по Формуле (2) рассчитывают вязкость исследуемой жидкости.Первым этапом исследования явля ется построение калибровочного графика ТГ(М ). Титр суспензии клетоки культуральной жидкости определяютпо стандартной методике. Титр находится в пределах (0-2)10 ф кл/мп, 13 величина вязкости при этом изменяется впределах 1-1,8 сСт,При статистической обработке полученных данны 3 Густанавливают зависимость ТГ И )в виде (1) с коэффициентами а =-3 и 2 О Ь =+10, что соответствует на графие (чертеж/ участку 1. Затем по этойривой определяют титр образца куль"туральной жидкости, для которой по-,лучают С = 48,5 с и ) = 1,47 сСт.25 Значение титра из калибровочногографика Т = 1,1 109 кл/мл.П р и м е р 2. Определяют изменение культуральной жидкости (биомассы) культуры Вас. депдго 1)вць отИспытывают около 50 образцовкультуральной жидкости штамма 49-8на капиллярном вискозиметре ВПЖ с диаметром капилляра 0,86 мм (К==О,02743) при температуре среды 30 С.Для этого 40 мл образца жидкостифнльтруют через фильтр с размерамиячеек 0,7-0,8 мм и заливают в вискозиметр. Заполненный исследуемойжидкостью вискоэиметр устанавлива ют в термостатирующее .устройство,аналогичное примеру 1, и выдерживают 15 мин. Затем при помощи секундомера замеряют время истечения жидкости через капилляри по формуле (2) 45 рассчитывают вязкость. Расчет среднего значения вязкости производят наосновании данных 5-7 измерений исследуемого образца жидкости.Строят калибровочный график. Для ф этого параллельно измерению вязкостипроводят микробиологический анализобразцов по стандартной методике,аналогично примеру 1, Затем после.статистической обработки эксперимен- И тальных данных в диапазоне вязкости2-3 сСт и титра 2-6 "10 фкл/мл получают зависимость (1) с теми же, чтои в примере 1,коэффициентами а=-3и Ь =н 10 (чертеж, участок Й ). Полу ченный график служит для определениятитра образцов культуральной жидкости. Так, для образца культуральнойжидкости получают Г = 88,2 с,9 =2,42 сСт, Из графика находят Т=5,3ф 10 кл/мп.100446 9 Формула изобретения ВЦИЯП Тираж ЫЪ аказ 1801/35 ПодписноеП р и м е р 3. Определяют изменение вязкости пасты (биомассы) культуры Вас. сЬцг 1 дд 1 епв 1 ь штамм 844 от титра. Паста. получается при концентрировании культуральной жидкости путем сепарации и отличается от культураль . ной жидкости меньшей влажностью и, соответственно, значительно большей концентрацией биомассы.Испытывается около 30 образцов пасты на капиллярном вискозиметре 10 ВПЖс диаметром капилляра 1,31 мм (К = 0,3399) при температуре среды 30 фС. Йетодика измерения вязкости (Фильтрация пасты, заливка вискоэиметра,. термостатирование, измерение 15 времени, расчет вязкости) аналогично примеру 2, Микробиологический анализ образцов по стандартной методике проводят анапогично примерам 1 и 2.Калибровочный график строится 2 после статистической обработки экспериментальных данных (диапазон вязкос" ти 3"27 сСт, титра - (6-30):10 фкл/мп) в виде зависимости (1) (чертезь учасгок 1 1).с такими же коэффициентами, как и для участков 1 и 11 прямой, Полученная кривая служит для определения титра образцов пасты. Так, для образца пасты получают= 66,2 с,22,5 сСт, Из графика находят Т = 28,3109 кл/мп." Таким образом, преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известным являются: сокращение времени определения титра микробной биомассы (15-20 мин), что позволяет в производственных условиях испольтвзовать способ в качестве экспрессконтроля и как минимум в 2 раза повысить точность контроля. Способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы. в процессе культивирования микроорганизмов на питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа и повыаения его точности, измеряют вяз кость-полученной биомассы, при. температуре культивирования микроорганизмов, а концентрацию жизнеспособных клеток определяют по формуле т-(а+ЬеэФ 09 .где Т - концентрация жизнеспособныхклеток, мп,- кинематическая вязкость биомассы, сСт,ОЬ- эмпирические коэффициенты,определяемые природой биомассы.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что перед измерениемвязкости биомассу Фильтруют.Источники информации,;принятые во внимание при экспертизе1. Задания к практическим занятиям по микробиологии. Л., ЛГУ,.1974.2. Большой практикум по микробиологии. Под ред. проф. Г.Л. Селибера.М., "Высшая школа", 1962. филиал ППП фПатент",г.ужгород,ул,Проектная,4