Способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБ ЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСНОМУ СВИДЕТВЪСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ 1 ТИЙ,(21) 3353734/23-04(56) 1, Хирт Дж., Леер З.де, Бейер-:ман Х. Контролирование твердофазногосинтеза пептидов,-В сб. "Химия поли-пептидов" под ред. П,Катсояниса,и.,1977, с. 404.2, Билибин А.Ю., Власов Г.П."Получение аминоацил.-сефадексов и использование и-толуолсульфокислотыдля определения их емкостей",ЖОХ,44, 1844 (1973),3. Билибин А,Ю., Кожевникова Н.ВВласов Г,П. "Изучение стадии ацили-:рования при синтезе пептидов на поли",мерных носителях", ЖОХ, 47, 217(1977).4.ЕЛыа 1 Е,.Р, Апогее, Ь. КаЕеваз. ЕЕЕесй оЕ СЬг Е 1 а гоасейсасЫ пров рос - аапоасу 1 апй росрерЕЫу 1 " Кезхпв. Ревсг 1 рйоп оЕ апед ро 1 упагхс вцррогй Еог зо 1 Ыржаве рер 1 Ые ВупгЬезъв.-ТейгаЬейгоаЕе, 1979, 3587 (прототип),(19) (11)1511 С 07 С 103/52//6 01 М 21/78(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОГРУПП В ПЕПТИДИЛ"ПОЛИМЕРЕ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ СИНТЕЗЕПЕПТИДОВ путем отбора пробы пептидилполимера и последующей последовательной обработки ее раствором основания, органическим растворителем,раствором кислоты, органическим растворителем н раствором основания ипоследующим определением ионогенносвязанной со свободными аминогруппамипептидил-полимера кислоты спектрофото.метрическим способом, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью снижениярасхода пептидил-полимера и органических растворителей и сокращенияпродолжительности определения, отборпроб осуществляют, капилляром с фильт"рующей перегородкой и последующуюобработку пробы ведут в капиллярепод давлением О, 1-2,0 кг/см.1 1084Изобретение относится к усовершенствованному способу определениясодержания свободных аминогрупп впептиднл"полимере при твердофазномсинтезе пептидов и может найти применение в синтезе биологическиактивных пептидов твердофазным методом.В настоящее время в синтезепептидов широко используется твердо Офаэный метод, который заключаетсяв последовательном наращиваниипептидной цепи, начиная с С-концевойаминокислоты, ковалентно присоединенной к нерастворимому полимерному, 15носителю 1.13.Процесс твердофазного синтезапептидов включает последовательноечередование стадии деблокирования -удаление - концевых защитных групп 20и стадии конденсации - присоединениезащищенной аминокислоты.Наиболее важным условием для успев.ного синтеза пептидов твердофазным методом является количественное за- . 21вершение всех реакций, так какочистка промежуточных продуктовневозможна. Степень завершенностихимических, реакций. определяетсяколичествами свободных аминогрупп30в пептидищ;полимере. В идельаномслучае кеМйчество свободных амивогрупп впфцФндил-полимере при дебло.кировании должно равняться общемусодержанию пептидных остатковв полимере, а при конденсации35должно снижаться до нуля,Однако из-эа неполного прохождения реакций, а также иэ-за побочных реакций, протекающих в процессе синтеза, необходим контрольвсех стадий твердофазного синтезапептидов. Этот контроль осуществляют путем определения содержаниясвободных амнногрупп в пептидилполимере после стадий деблокирования и конденсации.Большинство известных способовопределешия содержания свободныхаминогрунн в пептидил-полимере основано на способности свободных аминогрупн стехиометечески образовывать соли с кислотными агентами.Известен способ определения свободных айииеррупп в пептядил-полимере,которйй вкщочает обработку всего 55пептндал-вюимера нейтральным органическим растворителем, кислотнымагентом, оргащческим растворителем271 2и раствором основания для высвобожде ния ноногенно связанного со свободными аминогруппами кислотного агента, количество которого определяют спектрофотометрически 23 иЗ 3.В качестве кислотного агента используют и "толуолсульфокислоту Г 23 илн кислотный ярко"оранжевый 33.К недостаткам этого способа следует отнести использование всей массы полимера или довольно большой навески полимера и большие затраты времени на проведение анализа.Обработка всей массы полимера создает опасность взаимодействия основных группировок пептидной цепи с аналитическим реагентом, что мо жет привести к искажению результатов анализа, Кроме того, обработка всей массы полимера приводит к расходу больших количеств органических растворителей и аналитических реагентов.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полнмере при твердофазном синтезе пептидов, включающий отбор пробы пепдидилполимера и последующую ее обработ-, ку органическими растворителями и пикриновой кислотой в качестве кислотного агента. Согласно этому способу пробу пептидил-полимера весом 50 мг помещают на взвешенный фильтр, промывают дихлорметаном, сушат до постоянного веса и определяют вес пробы. Затем пробу промывают дихлорметаном, обрабатывают раствором триэтиламина, дихлорметаном, дважды обрабатывают раствором пикриновой кислоты в дихлорметане и промывают дихлорметаном. Ионогенно связанную с аминогруппами нептидил-полнмера пикриновую кислоту высвобождают обработкой раствором триэтиламина в дихлорметане. Количество соли триэтиламина с пикриновой кислотой определяют спектрофотометрнчески 41.К недостаткам этого способа следует отнести большой расход пептидил-полимера и органических растворителей для проведения одного анализа и большой расход времени на проведение анализа 60-90 мин, что снижает производительность способа.Цель изобретения - снижение расхода пептидил"полимера и органичес(мл на однупробу) Времяподачи,мин Раствор 107-ный триэтнламин в дихлорме 2,5 танеДихлорметан 0,5 н. пикриновая кислота 10 Дихлорметан107-ный триэтиламин в дихлорметане 10 19,5 Ито го: Вытекающий из капилляров раствор У 5, который содержит пикриновую кислоту, собирают отдельно:и разбавляют ацетоном до объема 200 мл.Концентрацию пикриновой кислоты определяют спектрофотометрически при 362 нм по калибровочным кривым. Полученные результаты представлены в табл.2. з 10842ких растворителей и сокращение продолжительности определения содержания свободных аминогрупп в пептидилполимере при твердофазном синтезе,Поставленная цель достигается5тем, что согласно способу определения содержания свободных аминогруппв пептидил-полимере отбирают пробыпептидил-полимера капилляром, сфильтрующей перегородкой и последовательной обработки пробы в капилляре органическими растворителями,раствором кислотного агента и раство.ром основания под давлением 0,12,0 кг/Осуществление предлагаемого способа позволяет снизить расход пептидилполимера до 4-8 мг и органическогорастворителя для проведения одногоанализа до 7-70 мл (с 220 мл), сократить время проведения анализа до25-40 мин ( до 90 иин в известномспособе).Сущность предлагаемого способазаключается в отборе пробы пептидил"полимера из реакционной среды точновзвешенным капилляром с фильтрующейперегородкой, который после отборапробы подключают к резервуару с растворителем и интенсивным потоком30растворителя под давлением отмывают от реагентов синтеза. Затем ка-.пилляр с пробой сушат до постояйного веса, взвешивают, подсоединяютк распределительному устройствуи поочередно под давлением пропус- З 5кают непрерывно следующие реагенты:Раствор тризтиламина в органическом растворителе.2. Органический растворитель.3. Раствор кислоты в органическом 40растворителе,4. Органический растворитель.5. Раствор триэтиламина в органи.ческом растворителе.Раствор 95,который вытекает изкапилляра, собирают отдельно дляспектрофотометрического определениясодержания кислоты, ионогенно связанной со свободными аминогруппамипептидил-полимера,50Количество кислоты, высвобожденной при обработке раствором триэтил"амина, эквивалентно содержанию свободных аминогрупп в пробе. пептидилполимера.55П р и м е р 1. Контроль реакциидеблокирования трет-бутилоксикарбонилглицил-сефадекса.4 71 41,0 г гранул трет-бутилоксиклр,онил-глицил-сефадекса помещают в реакционный сосуд, добавляют 5,0 мл 507. - ного раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Через определенные промежутки времени с помощью взвешенного капилляра с фильтрующей перегородкой отбирают пробы полимера. Затем капилляр подсое диняют к трубке для подачи органических растворителей и аналитических реагентов и пропускают в течение 5 мин под давлением 1,0 кг/см 2 дихлорметан и сушат до постоянного веса в вакууме и взвешивают. Затеи обработку проб в капиллярах осуществляют под давлением 1,0 кг/ см сог 2 ласно программе, приведенной в табл.1,1084271 Т а б л и ц а 2 Продолжение табл.3 Содержаниесвободныхаминогруппна 1 г глицил-сефадекса (Мм/г) Вес Количествовымытойпикриновойкислоты Времяотбора,мин г 3 пробы,г 5 Дихлорметан 20 2 10 Ж-вью триэтиламин в дихлорметане 20 1,8 0,45 10 И т о г о: 70 6,8 5 60 320 0,53 Полученные результаты представлены в табл.4. 10 6,5 3,78 15 6,3 330 20 6,0 3,08 0,58 Таблица 4 0,52 Содержание свободных ажногрупп на 1 кг глицил-сефадексаИм/г Время отбоВес Количествопро- вымытойбы, пикриновой г кислоты 0,51 ра,20 мнн0,52 30 6,75 3,52 0,49 2,5 5,9 ф 1032,4810 3 0,51 0,42 0,49 347 0,51 3,69 0,53 3,25 0,57 3,17 0,53 3,15 3035 40 6,1 0,50 0,58 60 6,3,68 0,55 2,97 40 90 5 4 0,55 120 7,1 3,48 0,49 Таблица 3 45 П р и м е р 3. Ко деблокирования трет-б бонил-глицил-сефадекс 1,0 г трет-бутилок цил-сефадекса подверг ванию аналогично прим нейщий контроль осуще гично примеру 1 с тем промывку проб в капилл вляют в течение 4 мин под давлением 2,0 кг/ шую обработку проводя 2,0 кг/см 2 по программтроль реакции тилоксикар Фикают ета,5 н. пикриноая кислота табл,2,5 6,6 1(Г 2,9 10 3 40 5,7 2,80 60 6,0 3,08 90 5,5 2,68 120 5,3 2,80 П р и м е р 2. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил-глицил-сефадекса.1,0 г трет-бутилоксикарбонил- глицил-сефадекса подвергают деблокированию аналогично примеру 1. Пробы промывают 10 мин в капиллярах, дихлорметаном под давлением0,1 кг/см 2 и затем обрабатывают аналогично примеру 1 с тем отличием, чт 6 обработку проводят под давлением О, 1 кг/см 2 по программе, прицедеинай в табл,З. 103"ный триэтиламин 1 Дихлорм н 1 5 6,8 10 6,7 30 15 520 60 рбонил-гли.деблокирору 1. Дальтвляют аналоотличием, что яре осущестдихлорметаном м , а дальнейпод давлением е, приведенной1084271 Таблица 5 Объем пропущ. раствора, мл,на 1 пробу Время подаРаствор чи,мин 107-ный триэтиламин в дихлорметане Дихлорметан 0,5 нникриновая кислота вдихлорметане 4 Дихлорме ган 103-ный триэтиламин в дихлорметане 8, 8 28 27,5 Итого: Таблица 7 Стадия9 л и ц а,б Т а.б Содержаниесвободныхаминогруппиа 1 г гли 2цил-сефадекса (Им/г) З 5 35 Времяотбора,мин Вес Количествовымытойпикриновойкислоты. бензил-серил-пропил-сефадоксу, полученному путем последовательного наращивания пептидной цепи, исходя из 5 г пролил-сефадекса с содержанием пролина 0,2 ммоль на 1 кг полимера прибавляют раствор 033 г (1,5 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-пролина в 20 мл дихлорметана. Через 15 мин прибавляют раствор 0,31 г (1,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл ди 55 хлорметана. Ход реакции контролируютпутем отбора проб пептидил-полимера капилляром с фильтрующейперегородкой.4 Обработку проб и определение содержа 5 66 376 0,57 2,86 10 5,2 15 бэ 5 Зю 20 0,50 3,01 0,51 20 5,9 30 6 13 2440 6,0 3,36 0,53 0,56 60 6,1 90 5,7 90 6,2 0,54 3,29 3,36 3,22 О, 5.2 120 5,9, 3,0 0,52 Полученные результаты представлены в табл.б. 8П р и м е р 4. Контроль реакциидеблокирования трет-бутилоксикарбониллейцил-глицил-оксиметил-полистирола,привитого на макропористом тефлоне.5 23 г пептидил-полимера деблоки руют в синтезаторе пептидов"ВесЬпап 990" по приведенной программе:1. Промывка дихлорметаном.2, Обработка 507-ным растворомтрифторуксусной кислоты в течение 20 мин.3. Повторение стадии 2.4. Промывка диоксаном.5. Обработка 4 н. раствором хлорис того водорода в диоксане в течение 15 мин. 6. Повторение стадии 5,После каждой обработки деблокирую щим реагентом отбирают пробу пептидил-полимера и определяют содержание свободных аминогрупп аналогично примеру 1.Результаты определения представ лены в табл.7. Вес пробы, Содержание105 г свободныхаминогрупп на 1 г пептидилполимера (мИ/г)9 1084271 ния свободных аминогрупп в пептидилполимере осуществляют аналогично при-.меру 1. Полученные результаты представлены в табл. 8. 10Таблица 9 О, 10 8,5 Таблица 8 5 0,85 20 Содержаниесвободныхаминогрупп30 на 1 г пеп тидилс ефа декса,, 10 М П р и м е р 7. Контроль реакции деблокирования трет-бутнл-оксикарбонил-лейцил-сефадекса.К 1 г трет-бутилоксикарбониллейцил-сефадекса прибавляют 5 мл 1 и. раствора П -толуолсульфокислоты в уксусной кислоте и через определенные промежутки времени отбирают пробы пептидил-полимера как описаноЯв примере 1. Дальнейшую обработку проб осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что обработку проб осуществляют под давлением .2,0 кг/см по программе, приведенной2ниже. 0,77 0,17 0,14 0,57 0,56 0,10 0,25 0,04 0,14 0,02 0,02 0,002 0,001 0,002 0,000 0,01 Таблица 10 0,02 Раствор Время подачи, мин ЗО 0,00 107.-ный триэтиламин вдихлорметане Этиловый спирт 0,5 М раствор п-толуолсульфоната пиридиния вднхлорметане Этиловый спирт 102-ный триэтиламин вдихлорметане Итого: 25 О Ф 5до ту 1,0 0,9 О, 15 0 13 7 2,5 4,5 5 4,0 10 5,8 20 6,8 30 6,8 45 6,0 60 6,0 90 5,0 120 7,0 П р и м е р 6. Контроль реакции конденсации трет-бутилокси-карбонилфенилаланина с лейцилсефадексом.К 10 г лейцил-сефадекса с содер,жанием лейцина 0,60 ммоль на 1 г приливают свежеприготовленный раст-. вор симметричного ангидрида третбузоксикарбонил-фенилаланина, приго О товленный из 6,36 г (24 ммоль) защищенной аминокислоты и 2,5 г (12 ммоль) дициклогексилкарбодиимида,Ход реакции контролируют путем отбора проб пептидип-полимера и определения в них содержания свободных аминогрупп аналогично примеру 1,Полученные результаты представлень 1 в табл,9.Таблица 9 Вытекающий из капилляров раствор собирают для каждой пробы отдельно 5 мл) и упаривают досуха на ротанном испарителе, остаток раствоют в воде, разбавляя в мерной колбе объема 10 мл. Концентрацию и -толсульфокислоты определяют спектфотометрически при 260 нм.нные анализов приведены в бл, 11.,11 Таб лица Вре отб рар мин Количество вющтой и-то- луолсульфокислоты (10 М) Отс шивани 15 .позвол на одн 30-40ствие периодическ и последующей фил т сократить расхо определение с 90 н го перемевременин до оставитель О. Галкинехред Т.факта Корректор А. Тяск Редактор А. Долин Заказ 1919 1/ 8 Тираж 410 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП патент 1, г. Ужгород, ул. Проек 4 ВВВЭЕЕ юв вМ 5 93 2156,0 30 82 38 45 80 41 60 8,04,590 80 45 Содержаниесвободныхаминогруппна 1 г амнноацил-сефадекса(мМ/г) 0,23 0,33 0,46 0,51 0,56 О 56 1084271 121 Отбор пробы пептидил-полимерас помощью капилляра с фильтрующейперегородкой и проведение . последующей обработки пробы растворйтелями и аналитическими .реагентами под:давлением О, 1-2,0 кг/см 2 позволяетснизить расход пептидил-полимерацля проведения одного определениядо 4-8 мг, а расход органи 10 ческих растворителей с 220 млдо 7-70 мл