Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий

СОЮЗ СОВЕТСНИХ ЦИАЛИСТИЧЕСНИХ СПУБЛИН А 091 ЗОБРЕТЕНИЯ ПИ ЬСТ СКОМУ СВИ Воробеи,уц, Е.А. ЧерницГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(71) Институт тепло- и массообменаим. А.В, Лыкова и Институт фотобиологии АН БССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИЖИЗНЕСПОСОБНЫХ СПОР БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности и можетбыть использовано для количественного определения жизнеспособных сйормикроорганизмов в различных препараСМ 4 С 12 С 1/00, С 12 Ы 3/О тах, в частности энтомопатогенных.Цель изобретения - упрощение способаи сокращение длительности определения. Готовят суспензию спор в дистиллированной воде, гомогенизируютдо получения однородной мелкодисперсной суспензии, прогревают при суболетальной температуре 69-75 С, вводят в питательную среду, выдерживают10-30 мин, отбирают пробу, устанавливают в термостатируемую ячейку полярографа, измеряют скорость поглощения кислорода и рассчитывают концентрацию (Т) жизнеспособных спормикроорганизмов по формуле: Т=К 7 )где К - эмпирический коэффициент,характеризующий культуру микроорганизмов, кл мин/мл м; 70 ) - скоростьпоглощения кислорода, м/мин, 1 з.п.ф-лы, 5.ил., 2 табл, 1303610Способ заключае Биомассу, в зав центрации спор мик (0,1-1 г сухого ко 10 г пасты, или 10 ной жидкости), сус дистиллированной вНижние пределы от чувствительност верхние определяют ности измерений пр поглощения кислоро терных для высокой роорганизмов,Полученную суспнизируют на микроилучения однороднойсуспензии, При испизмельчителя РТ ществляют 1,5-2 миреактивируют путемсублетальной темпепитательную средуоптимальной для роОтбирают пробу, усмостатируемую ячейрость поглощения ктывают концентрациных спор микроорга 1)й коэффициентщий культурузмов;глощения кислоИзобретение отн логической промысл быть использовано го определения жиз микроорганизмов в ратах.Целью изобретен щение способа и со ности процесса опрНа фиг. 1 изобр установки для осущ на фиг, 2 - зависи поглощения кислоро держивания после а 70 С в течение 10 зависимость скорос лорода спорами от при 60, 70 и 80 С; висимость скорости рода от концентрац изменение силы ток Т=К Ч(,где К - эмпирическ характериз микроорган Ч(- скорость п рода.сится к микробио.нности и может я количественно еспособных спор азличных препая является упроращение длительделения.ена блок-схема ствления способа; ость скорости а от времени вытивации и при 0 мин; на фиг. 3- и поглощения кисремени активации на фиг. 4 - запоглощения кисло- и спор; на Фиг5- во времени. ся в следующем. симости от коноорганизмов в ней центрата или 1- 100 г культуральендируют в 100 мл ды эазведений зависят установки, а я снижением точвысоких скоростяха в ячейке, харакконцентрации микнзию спор гомогемельчителе до помелкодисперсной льзовании микроомогенизацию осуЗатем споры прогрева их при атуре, вводят ввыдерживают при та температуре.анавливают в теру, измеряют скослорода и рассчи- (Т) жизнеспособизмов по формуле Коэффициент К определяют экспериментально. Для этого определяюттитр одного образца Т микробиоло 1гическим способом и скорость поглоще 5 ния кислорода Ч(данным способом,о,)Коэффициент К рассчитывают по ФормУле 1 иК= - .С10п Ч(о,)где и - количество образцов.Данный способ может быть осуществлен для определения количества жизнеспособных спор различных видов мик роорганизмовПредлагаемый способ осуществляетсяна установке представленной на фиг.1,Установка состоит из ячейки 1 смембранными датчиками типа Кларка, 20 полярографа 2, самописца 3, термостата 4 и магнитной мешалки 5.К рабочему электроду термостатиРуемой ячейки от полярографа подается напряжение, и после выдерживания 25 суспензии реактивированных спор вячейке в течение 20-30 мин при постоянном перемешивании магнитной мешалкой на самописце регистрируютизменение в ячейке силы тока, которое 30 прямо пропорционально изменению концентрации кислорода в образце.Скорость поглощения кислорода вобразце находят по ФормулеОг 3 1 -1 г 35 (О.)1,-1 Ч -цгде ОД - концентрация кислорода вдистиллированной воде при услоВиях(температура давление) измерения О;40 1, 1, - значения силы тока дляконтрольных растворов соответственнодистиллированной воды и бескислородного раствора (0,1 г сульфита натрияна. 100 мл воды), мкА;1 1 - значения силы тока для( Рисследуемого образца соответственнолв моменты времени , и. Величина =А (константа10 11,-150гячейки) характеризует чувствительность используемых датчиков ячейкик кислороду.-Ч - скорость изменелния силы тока в образце в единицувремени, которую находят из полярограммы, т,е,Ч(о1303610рабочий режим установки) записываютполярограмму (рис, 5).Рассчитывают концентрацию жизнеспособных спор следующим образом.Находят значение силы тока в моменты времени о =21 мин; 1, =0,8 мкА;-4 -ФЧ, =2 27 10 0,1=0,227 1 О м/мин;где 2,27 1 О м/мкА - константа ячейки,Коэффициент К для спор бактерий=0,35 10 2,27 10 =7,9 10 кл/млС учетом сделанных разведенийтитр сухого концентрата То в концентрате равен 79,2 10 кл/мг.П р и м е р 2. Для определенияконцентрации жизнеспособных спор используют препарат из Вас 111 цв СЬцгп 81 епя 1 я штамм 98,Для этого 1 г концентрата внеслив 100 мл дистиллированной воды. Дальнейшие операции повторили, как в примере 1,Экспериментально установлено, чтокоэффициент К для спор Вас 111 ця гйцг 1.пдепвгв У 98 равен 1,17+0,0810 кг мин/мл м.зИз полярограммы контрольных растворов находят16 .1 сГОЛПо Формуле А=находят1,-1,С помощью установки, описаннойвыше, была исследована зависимостьскорости дыхания спор бактерий Васд 11 ця гЬцг 1 пуепв 1 я от времени.Выявленная зависимость скоростипоглощения кислорода от времени активации представлена на Фиг. 2.Из представленных данных видно,что через 20 мин для различных образцов, независимо от времени активации, 10наблюдается постоянная скорость дыхания.Было исследовано влияние температуРы и времени активации спор на скорость поглощения кислорода (фиг. 3). 15Установлено, что при активации споропри 60 С скорость поглощения кислорода достигает максимума через 50 миннагрева.Скорость поглощения кислорода при 20ообработке спор при 70 С в течение20-50 мин максимальная, при увеличении продолжительности более 50 минотмечается снижение скорости погло=щения что обусловлено гибелью часЭоти спор. Активация же спор при 80 Спроисходит быстрее, но уже через1 О мин клетки начинают гибнуть.В связи с полученными данными оптимальными условиями активации спор 30бактерий Вас 111 цв гЬцг 1 пуепв 1 я являются: температура 70 С+1, время 2050 мин,Было установлено, что максимальная скорость поглощения кислорода 35 спорами пропорциональна конструкции клеток в исследуемом образце (фиг4).П р и м е р 1. Концентрацию жиз-неспособных спор определяют в сухом 40 препарате, полученном культивированием штамма Вас 111 ця гЬцг 1 пц 1 епя 1 я чаг йепдго 1 ппця 49-8Для этого навеску концентрата (0,2 г) разводят в 100 мл дистиллированной воды, го могенизируют на микроизмельчителе РТв течение 2 мин, Полученную суспензию прогревают в водяной бане прио70 С в течение 20 мин, затем охлаждают проточной водой.50В пробирку заливают 5 мл суспензии обработанных спор и 5 Мл водной питательной среды, содержащей 0,93 11 аС 1, 0,9 Е глюкозы и 0,1347. инозина. Полученную суспензию помещают в водяную баню и выдерживают 15 мин. Затем отбирают 1,5 мл суспензии, заливают в ячейку полярографа и через 10 мин (минимальное время выхода на 2,05 102,19 10 м/мкА; 7; =0,09 мкА/мин (из полярограммыисследуемой суспензии);Ч(, ) =О, 1 9 1 0 м/минТитр водной суспензии спорТс=Оф 19 10 1 ф 17 "10 =Ов 22 х х 10 кл/мл,при пересчете на сухой концентрат с учетом разведений Тх=44 10 кл/мг.П р и м е р 3. Исследовали споры Вас, яцЬг 111 я, выращенные на косяках мясо-пептонного агара. Суспензию спор гомогенизировапи и выдерживали в водяной бане при с=75 С в течение 15 мин для активации, затем охлаждали и разводили в отношении 1:1 питательной средой следующего состава: 0,9 г БаС 1+0,09 г глюкозы + 0,2 г1303610 1-К-аланина на 10воды. Затем образестатированную приграфа, выдерживалировали скорость пов образце.Экспериментальнэффициент К для справен: К=0,58 ф 0,04Из полярограммров получено 1-1рограмм исследуемо"г10=2,8турные данные.Скорость поглообразце равна:2 85 1 Оы о дистиллированной помещали в термос0 С ячейку поляро" 25 мин и регистрилощения кислорода Продолжение табл,1 Т 10 кл/мг по 9 способуод10 ф м/мин Опыт пред" микробиолагае- логичесмому кому 0,22 77,0 67,5 0,21 74,5 А/мин 72,8 Среднеезначе 22,9 80,33 74,48 ние ения кислорода в Средняяквадратичнаяошибка р образца равен:0,12" 10 =7 х25 10,11+8,01 яции результатов предлагаемым и изв частности микро- водили двумя путя" а спор Вас. ерш ЗО ого образца в семи еляли титр микроедлагаемым спосоТаблица 2 по определе особных спорнительн анн не нию концентрациибактерий Васд 11 плярографическим испособами предст,72 б позволяет анный с 5 7 скор ации труд внос 9,84,сни су5Ф 79,о б р е т,2 1, Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий,78,соответственно ти 1 Т=К 7 од 0,58 1 О х 10 кл/мл. 7 Проверку корр определения титра вестным способами биологическим, пр ми. Для концентра тдпядепздз для од повторностях опре биологическим и иопределенный кор Вас. зиЪйд 1 дз 10 кл мин/мл.м.Яонтрольных раство =0,9 мкА. Из полясуспензии: 4 " 1510 м - литера,04=0,12 1 О м/мин, 20 цгдщдепздз покробиологическим ны в табл. 1,40 Для спор Васд 11 цз зиЪ 1 д 1 дз (три образца в двух повторностях) определяли титр микробиологическим и предлагаемым способами. Результаты экспериментальных данных приведены в табл, 2,ить процесс определения жизнеспособных спор,оемкость и исключает ь.предусматривающий активацию спор путем выдержки их в питательной средев течение 15-30 мин и термообработкис последующим определением количестваспор расчетным путем, о т л и ч а - 5ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения длительности процесса определения, передвьщерживанием спор в среде спорывносят в дистиллированную воду, гомогенизируют, термообработку споросуществляют при сублетальной температуре в водной суспензии перед внесением в питательную среду, а послевыдерживания в среде отбирают суспензию спор и измеряют в ней скоростьпоглощения кислорода, а концентрациюжизнеспособных спор рассчитывают поформуле1(О.,)где Т - концентрация жизнеспособныхспор, кл/мг;К - эмпирический коэффициент, характеризующий культуру,кл мин/м млЧ - скорость поглощения кислорода,да, м/мин.2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что при определении количества жизнеспособных спор бактерий ВасПпз ЕЬогпдьепвв в качесТве питательной среды используют среду, содержащую 0,9 Ж хлористого натрия, 0,097 глюкозы, 0,1347. инозина, остальное - вода, а термообработку осуществляют при 69-11 С в течение 20-50 мин.1303610 Вс У МЮЮ Реда 1278/29 Тираж 500ВНИИПИ Государственного комитетапо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб сно а