Иммуносорбент

2) Авторы изобретени А.;Б Алек чный центр Смирнов, В.) Заявител ческий чэныи диол 4) ИпМУНОСОРБЕНТ Изобретеполучения илогических е относит уносорбен следовани обла в для иммуно собой Иммуносориммобилиэова нты предста специ ическим ный ела м ых характерист о емкост ется антие. то максим ое количество извлечь одни ел, ко илитро предел ммобили орое можнсорбента Емкость в основномеством антигена,на одном миллиметре ся кол Ванног е антигены или антитела, способныеакциям. ПереведенФорму они связыватигены), которыевятся нерастворииммуносорбент, упримеси, загрязнятел 1 или антигенпосле диссоциац гможно выделить вОдной из главнмуносорбента явля ные в нерастворимуюют антитела (или анпри этом также станомыми. Отмывая затемдаляют все возможныеющ;.е препарат антиа), которые далее,и иммунного комплексчистом виде. носителя и стерическои доступностью этого связанного антигена. Известны Земсков исее различные иммуносорбенты, Для их полу" чения белок ковалентно связывают с мат рицей. Сложность синтеза иммуносорбентов состоит в том, что различные антигены имеют очень широкий спектр физико-химических и иммунологических свойств, и поэтому фактически каждый антиген требует индивидуального подхода.Известен иммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связан с диазотированной парааминобензилц пюлозой (РАВ-целлюлоза 1),ГРЗ,Указанный сорбент получают следующим образом. Парааминобенэилцеллюлозу модифицируют - диазотируют емесьч соляной кислоты и нитрита натрия на хо" лоде. Затем при смешивании диазотированного производного ПАБ-целлюлозы с раствором коллагена происходит иммобилиэация последнего с образованием иммуносорбента.Недостаткоммалая емкость сорбента является его0,06 мг антител/мг кол=;хагена в сорбенте, поскольку не уда- ется иммобилизовать достаточно большое количество антигена (коллагена)на единицу объема иммуносорбента. Этопроисходит по многим причинам. Во-первых, коммерческий препарат ПАБ-целлюлозы имеет малое количество парааминобензильных групп и они труднодоступныдля таких крупных неглобулярных белков как коллаген. Во-вторых, получаемое при диазотировании активное производное ПАБ-целлюлозы не стабильнов физиологических условиях, при кото рых происходит иммобилизация. Кромеэтого, стерические затруднения приводят также к тому, что иммобилизованныебелки, имеющие малое количество антигенных детерменант, как, например,коллаген, плохо работают как иммуносорбенты. Кроме того, изготовление иммуносарбентов на основе ПАБ-целлюлозыочень трудоемка, Полученные по этомуметоду сорбенты мало подходят для колоночной аффинной хроматографии вследствие малой механической прочности,которая вызывает усику сорбента в колонке и затрудняет работу с ним,Целью изобретения является новыйиммуносорбент на основе коллагена 1типа, обладающего высокой емкостью,механической прочностью и минимальнойнеспецифической сорбцией компонентовсывороток.Указанная цель достигается свойствами нового иммуносорбента, представляющего собой коллаген 1 типа, связанный с модифицированным полиакриламид. -ным гелем и имеющий следующий элементарный состав,1,на сухое вещество),%:С 50,7010,02Н 7,04+0,010 22,5310,01Н 19, 7210,015 0,003 0,001Соединение представляет собой бе-..лый водонаполненный гель с содержанием воды от 75 . до 97 , слаборастворимо в диамине и не растворимо в воде,водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте.Способ получения нового иммуносорбента основан на известном методе 21иммобилизации белков на полиакриламидном геле, модифицированном глутаровым альдегидом и осуществляется следующим образом.Сначала проводят модификацию полиакриламидного геля, которую ведут длительно и в большом избытке глутарово 3053 35 40 45 50 55 5 1 О 5 20 25 304го альдегида при комнатной температуре, так как амидные группы полиакрил амида реагируют с альдегидами не очень активно, При использовании 3-10% глутаровоГо альдегида в реакционной смеси за 10-30 ч при комнатной температуре достигается высокая степень модификации исходного геля. После окончания активации удаляют избыток глутарового альдегида и тщательно омывают водой активированный гель. Так как получаемое на этой стадии активное производное полиакриламида и глутарового альдегида вполне устойчиво при физиологических условиях в широком интервале температур, дальнейшую иммобилизацию коллагена с полученным ранее гелем проводят в фосфатном буфере рН 8,0-9,4 при 16-25 С в течение 20-60 ч с последующим восстановлением азометиновых связей и альдегидных групп продукта. В результате степень пришивки белка подчас превышает 90%, т.е. почти весь коллаген связывается с нерастворимой матрицей-гелем.Предлагаемый иммуносорбент позволяет сорбировать более 0,2 мг белка антител на 1 мл сорбента, что более чем втрое превышает аналогичный показатель известного сорбента. Полученный иммуносорбент .отличается механической прочностью и химической стабильностью. Высокая механическая прочность обеспечивается использованием в качестве матрицы гранулированного полиакриламидного геля. Химическая стабильность связана с химической стабильностью геля-носителя и,высокой устойчивостью коллагеновых белков к различным денатурационным воздействиям, и с тем, что образовавшиеся в ходе иммобилизации относительнолабильные азометиновые связи (основания Шиффа) в конечном продукте восстановлены, Указанные свойства позволяютв хроматографических колонках, наполненных сорбентом, обеспечить высокуюскорость подачи раствора. Так, нанесение сыворотки и элюция проводятся соскоростью 1-2 мл/см , а отмывка колонки от неспецифически связавшихся белков - со скоростью 3-20 мл/см, чтовдвое быстрее, чем с известным сорбентом. Сорбент выдерживает многократныеобработки водными растворами буферомс рН от 2 до 11, водными растворами8 И мочевины, 5 И гуанидина, 3,5 Мроданида натрия.883053 20 30 суток перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре гель отфильтровывают, промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, 1 л 1 И хлористого натрия и снова 1 л 0,15 М10 фосфатного буфера рН 9,0. Охлаждают гель в 0,15 М фосфатном буфере рН 9,0 до 0 С и, насухо отфильтровав, вноосят его в охлажденный до 0 С раствор цы П р и м е р 3. Условия получения соединения идентичны описанным в примере 1 за исключением времени активации носителя глутаровым альдегидом, которое в данном случае составляет 9 ч. Полученное соединение содержит 1,2 мг иммобилизованного коллагена 1 типа на 1 мл геля конечного продукта. Общий объем полу",енного геля составляет 240 мл. Количество соединенного с ноОтмеченные химическая стабильность,и механическая прочность предлагаемого иммуносорбента позволяют использовать его в различных иммунологическихисследованиях лабораторий и клиник десятки раз без заметного изменения сорбционных свойств и не перепаковывая хроматографические колонки.Предлагаемый иммуносорбент обладает также очень низкой неспецифической сорбцией (около 1,7 мкг неспецифических белков на 1 мл.сорбента).П р и м е р 1. 60 гсухого гранулированного полиакриламидного геля (р,змер гранул 35-75 мкм) суспендирую 1 в 300 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 8,5. Набухший гель занимает объем 230 мл. В суспензию вносят 150 мл 257-ного глутарового альдегида, доводят рН до 8,0 и оставляют перемешиваться на магнитной мешалке при комнатной температуре на сутки. После этого полученный активированный глутаровым альдегидом гель отмывают на воронке со стеклянным фильтром раствором хлористого натрия до полного исчезновения запаха глутарового альдегида иеще 1,5 л 0,15 М фосфатного буферарН 9,0. Отфильтрованный насухо гельвносят в 230 мл раствора с концентрацией 2,3 мг коллагена первого типа вмиллилитре фосфатного буфера 0,15 М,рН 9,0. Общий объем реакционной смеси 440 мл, в ней содержится в общей сложности 529 мг коллагена. После трех 5 г боргидрида натрия в 150 мл этого же буфера. Реакционную смесь интенсивч но перемешивают на холоде магнитнои мешалкой в течение 40 мин, а затем отфильтровывают. Полученный восстановленный гель промывают 1 л холодного 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, а затем при комнатной температуре заливают гель буфером 0,2 М глицин-НС 1 рН 2 2 для полного разложения остатков бо гидрида натрия, После прекращенияр55 выделения пузырьков водорода гел промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера Р Н 9 0 и затем 2 л изотонического раствора хлористого натрия, Получается 240 мл геля, пригодного для использования в качестве иммуносорбента. Один миллилитр конечного продукта содержит 2 мг иммобилизованного колла- гена 1 типа (т.е. 90,77 введенного в реакционную смесь белка иимобилизуется на носителе) . Состав сухого. вещества иммуносорбента включает 50,707. углерода, 7,047. водорода, 22,53 Ж кислорода, 19,727. азота, 0,0037. серы, Полученное вещество представляет собой водонаполненный гель белого цвета, содержащий 757. воды, который не растворяется в воде, водных растворах солей и ни в каких распространенных органических растворителях за исключением диамина. Хранят полученный иммуно-сорбент при 4 С в изотоническом растворе хлористого натрия с добавлением 0,027 азида натрия.П р и м е р 2. Условия получения соединения идентичны описанным в примере 1 за исключением того, что в качестве носителя для приготовления иммуносорбента берут 5 г крупнопористого гранулированного полиакриламидного гранулированного полиакриламидного геля (с тем же размером гранул . Общий объем полученного геля составляет 180 мл. Полученное соединение содержит 1, 1 мг иммобилизованного коллагена 1 типа на 1 мл геля конечного продукта. Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,703 углерода, 7,047 водорода, 22,53 кислорода, 19,727, азота, 0,0027. серы. Полученное вещество представляет собой водонаполненный полиакриламидный гель, содержащий 977. воды.Как видно из примеров 1 и 2, понижение содержания сухого вещетсва в составе геля-носителя с 257. (пример 1) до 37 (пример 2) приводит к снижению содержания иммобилизованного коллагена в конечном продукте из-за уменьшения количества активных групп, возникающих в результате активации матри883053 8ки антитела растворены в изотонп .ском растворе хлористого натрия нейтрального рН, не содержащем глицпп.Полученные элюаты, содержащие чистые антитела, при необходимости концентрируют ультрафильтрацией и хранят замороженными при -25 0 С. Формула изобретения 1 О сителем коллагена зависит от степени активации носителя.Как видно из примеров 1 и 2, на свойства полученного сорбента влияет время активации носителя глутаровым альдегидом, которое должно быть не ме нее 1 О ч, Активация длительнее 30 ч нецелесообразна, так как это не ведет к увеличению степени пришивки колла- гена к носителю.Сорбционная активность полученных соединений иллюстрируется следующим примером.П р и м е р 4. 30 мл иммуносорбента, полученного в примере 1, заполняют колонку диаметром 16 мм и длиной 160 мм. Колонку с сорбентом, предварительно обработанным нормальной сывороткой, промывают 100 мл буфера 0,1 глицин-НС 1 рН 2, 2, а затем изотоническим раствором хлористого натрия до нейтрального рН выходящего раствора. После этого наносится 100 мл им-: мунной сыворотки с титром 1;1000 по РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) со скоростью 20-30 мл/ч, которая смывается изотоническим раствором хлористого натрия до нуля оптической плотности при 280 нм выходящего из лонки раствора. Обычно требуется 300- 500 мл, жидкости для полного отмывания колонки от неспецифических белков, Для элюции связавшихся с сорбентом антител используют 100 мл 0,1 М буфера глицин-НС рН 2,2 при скорости протока 5-10 мл/ч. Иэ 100 мл указанной иммунной сыворотки элюируется около 6 мг чистых антител, причем основная их часть выходит из колонки в объеме 6-10 мл. При этом выходящие иэ колонИммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с модифицированным полиакриламидным г е лем, имеющий следующий элементарныйсостав на сухое вещество 1, %:С 50,70 ф 0,02Н 7,0410,00 22,5310,0120И 19,720 уО5 0,003+0,00,1 Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 75 до 97 , слаборастворим в диамине и не растворим в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте.,Источники, информации,принятые во внимание при экспертизе1. В. Т 1 вр 1, Н. ГцгйЬвауг, С,ЬеГГеп, И.Оо 1 езсЬе 1, "зо 1 аоп оГ рцгеапй 1-со 11 адеп апС 1 Ьод 1 ез цз 1 пд а зресГ 1 с ввцпоадзогЬепй сесЬпдце",2,ввцп гсазгогзсЬ, 1967, 134, 4,З .391-396.2, Иммобилизованные ферменты. Подред. И.В. Березина, В,К. Антонова,К, Мартинека. Т, .1, М., 1976, изд-воМГУ, с. 184.Составитель О. СкородумоваРедактор Т. Кугрышева Техред Н; Майорош Корректор М ПожоЗаказ 10113/31 Тираж 400 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва ЖРаушская наб.д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4