Иммуносорбент

ОП ИСАНИЕизовеитинияК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик и 883052(22) Заявлено 14.11. 79 (21) 2855420/23-04с присоединением заявки Эй(51) М. Кл. С 07 0 7/00 С 12 Н 11/08 6 01 й 33/54 Государственный комнтет по делам нзооретеннй н открытнй(72) Авторы изобретения А. Б. Алексеев и В, И. Земсков 71) Заявитель есоюзный кардиологический научный це(5 НОСОРБЕ сти зобретение относит к о стью и обпод котока, иммо- . са или обьполучени в для муносорбессле ова муно ны 1 освобожда чистом виде. са а ются Отсю титела (или анти с иммуносорбента осорбенты долж 20 а видно, вечать ря ы обладат не разру ьзовании иммутребо ании, 1. е., оювской прочное ны ь механич аться при тью,испо ногократн обладать неспецифилогических и д нии.Иммуносорбенты достаточно широко применяют в иммунологических и биохимических исследованиях для выделения высокоочищенных препаратов антител антигенный.иммуносорбент или белков антительный сорбент , Для этого исследуемый белок тем или иным способом связывают с полимерным носитет лем, полагая, что и сле образования нерастворимого иммунного комплекса на иммуносорбенте появляется возможность максимально полного освобождения препарата от различных примесей. После диссоциации иммунного комплекческой сорбционной способноладать достаточной емкостьюрой понимают количество белбилизованного на единице веема носителя.Известен иммуносорбент на основе коллагена 1 типа, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с диазотированной п-аминобензилцеллюлозой РАВ-целлюлоза) . Способ получения данного соединения включает стадии предварительной подготовки носителя, т.е. диазотирование РАВ-целлюлозы смесью соляной кислоты и нитрита натрия и связывание диазотированного носителя с коллагеном 1 типа 111.Недостатками известного иммуносорбента являются недостаточно высокая емкость (0,06 мг антител/мг коллагена, содержащегося в сорбенте,или 0,Лб мг антител/мг сорбента, или 1 мг коллагена/мл сорбента), а также недостаточная механическая прочностьКроме того, структура и свойства иммуно 883052еорГсита обуславливает необходимостьиспользования для элюции антител определенного элюирующего агента - трипсиновых фрагментов коллагена, получение которых само по себе представляетдополнительную трудоемкую процедуру,в результате чего усложняется и использование сорбента.Целью изобретения является новыйиммуносорбент на основе коллагена 1 1 Отипа, обладающий улучшенными свойства,ми по сравнению с известным набольшейемкостью и механической прочностью)и обуславливающий более простые условия использования в иммунологической 15практике, а также расширение ассортимента иммуносорбентов на основе коллагена 1 типа,Цель изобретения достигается свойствами нового иммуносорбента - коллаОгена 1 типа, связанного с модифицированным сополимером акриламида - Й, 11-метилен-бис-акриламида-агарозы, имеющего следующие элементарный состав ихарактеристики (на сухое вещество), .:С 52,3-54,8Н6,5-10,7И 4,3-4,5О 32, 7-34, 20,002-0,005Соединение представляет собой белыйводонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96 , слаборастворимо вдиамине, не растворимо в воде, спирте,ацетоне, уксусной кислоте и эфире.Способ получения этого продукта,используемого в качестве иммуносорбента, основан на известной реакции связывания белков.с карбонилсодержащиминосителями образованием азометиновыхсвязей между аминогруппами белка икарбонильнымн группами носителя 121.Введение карбонильных групп на поверхность носителя осуществляетсяобычно обработкой альдегидами, наиболее часто для такой модификации исполь 45зуется глутаровый альдегид.Способ получения предлагаемого соединения осуществляется следующим образом.Сополимер акриламида М, И -метилен О-бис-акриламида-агарозы модифицируютдействием глутарового альдегида в фосфатном буфере, рН - 7.,6 в течение14-16 ч. К активированному таким образом носителю в растворе добавляют 55коллаген 1 типа и ведут реакцию связывания белка с носителем при комнатнойтемпературе в течение 14-16 ч или в течение 48 ч при 4 С е воелецующил 1 восстановлением азометпновых связей и альдегидных групп продукта. Получе- ный иммобилизованный коллаген 1 типа проявляет свойства иммуносорбента, обладает высокой емкостью, хорошей регенерационной способностью и удобен при работе.на хроматографических колонках из-за хороших механических свойств.В частности, при синтезе иммуносорбента к носителю присоединяется до 90 белка, участвовавшего в реакции иммобилизации, что в 2 раза превышает аналогичный показатель у известного сорбента. Емкость полученного сорбента составляет: 0,17 мг АТ1 антител) на мг коллагена сорбента, или 0,22 мг АТ/мл сорбента, или .1,3 мг оллагена/мл сорбента, что в 3-4 раза превышает емкость известного сорбента. Поскольку оба сравниваемых сорбента в единице объема содержат примерно равное количество иммобилизованного коллагена 1,3 мг и 1 мг в 1 мл сорбента), увеличение емкости сорбента можно объяснить созданием оптимальных условий стерического взаимодействия при образовании иммунного комплекса на иммуносорбенте.Кроме того, элюцию антител на предлагаемом сорбенте ведут обычно употребляемыми агентами - 0,2 М глицин-НС 1 рН - 2,2 без применения трипсиновых фрагментов коллагена. Процесс упрощается и при этом примесь неспецифических белков не увеличивается.Предлагаемый иммуносорбент наряду с повышенной емкостью обладает механической прочностью, химической стаг бильностью и низкой неспецифической сорбцией. Отмеченные характеристики обусловлены выбором в качестве носителя гранулированного сополимера акриламида Й ,Й -метилен-бис-акриламида-агарозы, что, наряду с чисто механической устойчивостью, создает лучшие условия при образовании на сорбенте иммунного комплексаП р и м е р 1. 110 мл сополимера акриламида, Н -метилен-бис-акриламида-агарозы марки АсАразмер частиц 60-1401 мол.вес. 20000-120000,содержание акриламида 4%, агарозы 4%1 многократно отмывают дистиллированной водой до полной прозрачности надосадочной жидкости. Далее суспензию доводят до 6% содержания раствором 25 . глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6 и оставляют при слабом88 О" 2 4 е)емеиИвс6р е(1 Гвктн)итемератур. 11 осле оксннация активации избыток глутарового альдегида удаляют и гель тщательно отмывают ди.тиллированной водой до полного отсутствия следов глутарового альдегида. Ксуспензии затем добавляют раствор коллагена 1 типа на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 2 мг/млвсего 195 мг коллагена ) и смесь инкубируют при слабом перемешивании.втечение 46 ч при 4 С, затем несвязавшийся белок отделяют многократнымпромыванием фосфатным буфером рН 7,4и проводят восстановление сорбента 1 Враствором боргидрида натрия на этомже буфере с конечной концентрацией 1%в течение 45 мин при 4 С. Полученныйсорбент отмывают 1 л 0,1 М фосфатногобуфера рН 7,4, 0,5 л 0,2 М глицин-НС: МрН 2,2 и вновь 1 л 0,1 М фосфатногобуфера рН 7,4.Получают 130 мл геля, 1 мл которого содержит 1,3 мг иммобилизованногоколлагена 1 типа (т.е. 90% взятого в иреакцию белка иммобилизируется на носителе) . Состав сухого вещества следующий: С 54,8%; Н 6,4%; Ь 4,6%; 0 34,2%,Я 0,002%. Продукт после добавлениямертиолата (1:10000) или азида нат- уррия (до 0,2%) хранят при 4 С,Удлинение времени иммобилизацииколлагена 1 типа нецелесообразно, поскольку при этом усиливаются процессыдеструкции молекулы белка. Точно так 33же нецелесообразно увеличение величины рН.П,р и м е р 2. Условия получениясоединения идентичны огисанным в примере 1 за исключением того, что вместосополимера акриламида-М,М -метилен-бис-акриламида-агарозы марки ЛсА,берут марку АсА(содержание.акрил 7 11 Формула из;",р тания О 32,7-34,25 0,002-0,005Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96%, слабо- растворим в тиамине, не растворим в воде, .спирте, ацетоне, уксусной кислоте и эфиреИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе1. К. Тир, Н. ГцгсЬшауг, С.5 егГеп, И ОоезсЬе зоасоп оФ рогеИммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с моди"фицированным соолимерон акриламида, М -метилен-бис-акриламида-агарозы,иеющий следующий элементарныц составна сухое вееств 1), г,:С 52, 3-54,86,4-О,,3 ни 1 а 2%, агарозы 2%). г 1 ун 100 млгеля, 1 мл которого содержит 1,3 мгиммобилизованного коллагена 1 типа.Состав сухого вещества иммуносорбента следующий: С 52 у 3%1 Н 10 у 7%1 М 4 у 3%у0 32,7%; Ь 0,005%,Данные соединения были использованы как иммуносорбенты.Сорбционная активность их иллюстрируется примером 3.П р и м е р 3. 130 мл иммуносорбента, полученного в примере 1, заполняют хроматографическую колонку диаметром 16 мм и длиной 25 см. Колонку ссорбентом (все операции ведутся при4 С 1, промывают 0,5 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 со скоростью 20 мл/чзатем 200 мл 0,2 М глицин-НС 1 рН 2,2и снова фосфатным буфером до нейтрального рН. После этого наносят 100 мпиммунной сыворотки со скоростью20 мл/ч и колонку отмывают фосфатнымбуфером до нуля оптической плотностивыходящего из колонки раствора. Антитела с колонки элюируют 0,2 М глицин-НС рН 2,2, нейтрализуют 4 Мтрис-НС 1 рН 7,4, диализуют против фосфатного буфера в течение ночи и концентрируют. Сконцентрированные антитела осветляют центрифугированием, разливают на аликвоты и хранят замороженными при -25 ОС. Проведенный иммуноэлектрофоретический.и иммунодиффузионный анализ показал, что полученные препараты содержат антитела, относящиеся к Г классу и не содержат примеси неглобулиновых белков.Полученный иммуносорбент может быть использован более 15 раз в течение 6 мес. без потери сорбционных свойств. Количество антител, полученных в течение 15 выделений из 100 млсыворотки, представлено в таблице.2. Иммобилизованные ферменты. Подред. И.В. Березина, В.К. Антонова,К, Мартинека Т. 1., М., 1976, изд-воМГУ, с. 184. 7 ,883052апй 1-со 11 адеп апс 1 Ьодюез цзйпд а пресГ 1 с 1 епцпоад зогЬеп есап 1 цое",1 пюап 1 йа 1 зГогза, 1967, 134, 4,391-396.Составитель О. СкородумоваРедактор Т. Кугвьппева Техвед Д,Гаврилещко Корректор А, ФеренцПодписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Заказ 10113/31 Тираж 400 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Ж, .Раушская наб. д. 4/5