Способ получения иммобилизованных нуклеаз

вафсф Своз СоветскихСоциалкстнческихРеспублик и 730690 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет -Опубликовано 30.04,80, Бюллетень И 16Дата опубликования описания 02.05,80 но делан изобретений н открытий(72) Авторы изобретения Б. М. Куриненко, И. Е, Черепнева и И. И. Алексеева Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И, Ульянова(,Ленина)(54) СПССОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КУКЛЕ АЗИзобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов посредством их связывания с растворимой матрицей, который может быть чспользован в медицине для получения лекарственных препаратов на основе ферментов (эн 5 зимотерапия), а также в промышленности, Иммобилизованные на декстранах ферменты могут применяться в реакторах промышленного типа при создании циклических и непрерывных технологических проС цессов с использованием полупроницаемых мембран для удаления продуктов реакции из смеси фермента с субстратом.Перспективы использования ферментов5 как лекарственных препаратов очень велики, однако применение их в настоящее время довольно ограничено и не отвечает потенциональным возможностям столь эффективных катализаторов, Одним из недостатком ферментов, .ограничивающих их применение в качестве лекарственных препаратов, являетоя их низкая стабильность, вследствие чего ферменты, введенные в организм в ка 1 естве биологически активного вещества или лекарственного препарата, очень быстро разрушаются.Известпо несколько способов увеличения стабильности ферментов: физико-химические методы, основанные на подбореоптималытых для хранения ферментов условий ( р, рН,1 активаторы и т.д.) Я ,иммобилизации ферментов на нерастворимых матрицах 2 и микрокапсулирование, т.е, включение нх внутрь мельчайшихкапсул, непроницаемых для фермента Я.Для усиления биологической активности ферментов методы подбора оптимальныхусловий непригодны, так как эти условияможно поддерживать только а ч Кто, ноне в организме, гомеостатические механизмы которого изменят эти условия всоответствии со своими внутренними параметрами и,Иммобилизации ферментов на нерастворимых матрицах может быть пригодна длясиления биологической активности ферментов в тех редких случаях, когда они вы 3 7306полняют свои функции в организме в нерастворимом виде (например, усиление пищеварительной функции желудочно-кишечного тракта).Микрокапсулирование пает возмож 5ность получать стабильные ферменты винъекциопной форме, и, следовательно, может расцениваться как способ усилениябиологической активности ферментов. Однако стенки микрокапсул непроницаемы 1 Одля макромолекул фермента. Равным образом и субстраты, имеющие молекулярный вес, соизмеримый с молекулярным весом фермента, а тем более превосходящимего (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды), внутрь капсулы проникать немогут. Следовательно, микрокапсулированные ферменты не катализируют превращение таких субстратов и этот способ усиления биологической активности ограничен 20ферментами, превращающими низкомолекулярные субстраты, проникающими черезмембрану микрокапсулы.Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации ферментов 25посредством их связывания с водорастворимыми матрицами4.По этому способу иммобилизацию ферментов осуществляют следующим образом,Йекстран, ЙЭАЭ-декстран или растворимую КМ-целлюлозу растворяют в воде,рН 11,0, добавляют при перемешиванииводно-ацетоновый раствор 2-амино,6дихлоро -триазина. Реакцию останавливают подкислением реакционной смеси до 35рН 3,0-4,0. Активированные полимерыосаждают ацетоном, переосаждают и используют для связывания с ферментами.Связывание проводят, добавляя к раствору активированного полимера в боратном 40буфере (рН 8,8) раствор фермента и выдерживают реакционную смесь в течение16 час при комнатной температуре, Реакцию останавливают доведением рН смесидо 6,0 и удаляют несвязавщийся фермент 45ультрафильтрацией. Для иммобилизациифермента используют препараты декстранаи ДЭАЭ-декстрана с молекулярным весомпорядка 2000000,Цель изобретения - усиление биологической активности нуклеаз с сохранениемих инъекционной формы, т.е. обеспечениеих проницаемости и создание эффективнойконцентрации во внутренней среде организма в течение продолжительного време 55ни и увеличение противовирусного и противоопухолевого действия препаратов.Указанная цель достигается тем, чтонуклеазы выделенные из организмов, фиР 90 4.логенетически удаленных от организма- мишени, ковалентно связывают методом диазосочетания с растворимой матрицей, м-аминобензилоксиметилдекстраном, причем используют м-аминобензилоксиметилдекстран с мол,вес. 40000-60000,Для нахождения оптимальных парамет- ров для препаратов нуклеаз, обладающих 1 противовирусным и противоопухолевым действием, изучают зависимость между мол.вес, иммобилизирующего декстрана и биологической активностью модифицированных нуклеаз, Устанавливают, что выраженной биологической активностью, в пределах в личин, приведенных в табл, 1, обладает только нуклеаза, связанная с декстраном с мол.вес, 40000, фермент, связанный с декстраном с мол,вес. 20000 и 60000, имеет стабильность, практически одинаковую с ферментом, связанным с декстраном с мол.вес, 40000, Однако он обладает противоопухолевым действием только при контактном (непосредственном) способе воздействия на опухоль (опухоль развивается внутрибрюшинно - фермент вводится внутрибрюшинно), При опосредованном способе воздействия (опухоль развивается внутрибрюшинно - фермент вводится внутримышечно; опухоль развивается подкожно - фермент вводится внутримышечно) биологическая активность модифицированных ферментов не отличается от таковой нативн ого.Это объясняется тем, что фермент, связанный с декстраном с мол.вес.60000, пе распространяется в организме, оставаясь локализованным в месте введения и, следовательно, не достигает опухоли при попытке опосредованного воздействия на нее, Скорость распространения в организме фермента, связанного с декстраном с мол, вес, 20000, не отличается от скорости распространения нативного фермента, Тем самым модифицированный фермент быстро выводится из организма, его эффективная концентрация создается только в месте введения и быстро падает из за выведения фермента из организма. Таким образомнаряду со стабильноотью модифицированного фермента молекулярный вес модифицирующей матрицы имеет большое значение для увеличения би логической активности фермента. М олекулярныи вес матрицы должен быть таким, чтобы обеспечить проницаемость фермента и наибольшее время поддержания его эффективной концентрации в организме. Для нуклеазь бег . тасеьсег ь,модифици 5 .730690рованной декстраном, наиболее оптимальным является его мол.вес., равный 40000.Для рибонуклеазы несколько шире -40000-60000,Усиление биологической активностиферментов поясняеп:я примерами нуклеазы Ье,яасесео и рНказы Ас 1, йгдсмзовпоскольку они выделены из организмов, далеко отстоящих в филогенетическом отношении от организма-мишени (мле копитающие). Ковалентное связывание сдекстранами нуклеолитических ферментов,выделенных из организма млекопитающих,например панкреатических ДНказы и РНказы, также сопровождается их стабилизацией, но не приводит к заметному усиле-нию биологической активности этих ферментов, остающейся на уровне биологической активности дативных ферментов, Мханизм этого явления имеет непосредствен-Оное отношение к вопросу усиления биологической активности ферментов,Панкреатические нуклеазы, вы деленныеиз поджелудочной железы крупного рогатого скота, при введении в организм млекопитающего-мишени эффективно ингибируются ингибиторами мишени, По отношнию к нуклеазам, выделенным иэ,филогенетически удаленных организмов, ингибиторные механизмы мишени мало эффектиэ- ЗОны в силу их филогенетической удаленности от ферментов, Поэтому введение в организм млекопитающего одой и той жедозировки в равной мере стабилизированных ферментов, но выделенных из разных. источников, сопровождается разным уровнем подъема каталитической активностиданного типа в организме, Наибольшийуровень подъема активности наблюдаетсяпри введении в организм стабилизированного фермента, филогенетически удаленного от организма-мишени. В результатеи биологический эффект единицы каталитической активности, введенной в организм ,противоопухолевое и противовирус 45ное действие на единицу активности) дляэтого фермента имеет более высокое значение.Наблюдаемое явление носит общий характер, т.е. в любом случае увеличение51биологической активности ферментов максимально при стабилизации ферментов, филогенетически удаленных от организмамишени. Возможны частные случаи увеличения биологической активности при стабилизации филогенетически родственныхферментов, если при этом происходит нарушение их взаимоотношений с ингибиторными системами организма-мишени, однако на данном этапе развития они не носят закономерного характера,Иммобилизация ферментов осуществляется путем их связывания с растворимойматрицей методом диазосочетания. С помощью метода диазосочетания возможноосущеСтвить связывание через амико,сульфгидрильные-, циклические и гетероциклические группы аминокислот, что позволяет осуществлять связывание черезмаксимально возможное число точек иследовательно, получать наиболее стабильные препараты ферментов, Мультипотентность реакции диазосочетания дает такжевозможность направленно изменять ассортимент иммобилизованных ферментов, связанных с декстраном через качественноразличные аминокислотные остатки.Процесс проводят следующим образом.Активированные путем введения в нихм-амипобепзилоксиметилыого радикаладекстраны обрабатывают раствором Яа 80в 0,5 н. НС 1 при температуре от 0 до+2 С; рН образовавшегося раствора диОазодекстрана доводят до 3-4, ферментырастворяют в 0,2 М трио-НС 1 буфера(рН 8,5) и добавляют при перемешиваниик диазодекстрацу., Смесь оставляют на10-14 ч при 20 ОС,Ковалентно связанные с декстранамиферменты отделяют от продуктов реакциипри помощи гельфильтрации на сефадексахЯ -75 или -100. В результате увеличивается в 3-5 раза стабильность ферментов, характеризуемая термостабильностьюстабильностью при хранении, стабильностью в растворах мочевины и во внутренней среде организл 4 а, Очищенные ковалентно связанные с декстраном ферменты используют далее в качестве лекарственныхпрепаратов,П р и м е р 1. Получение и изучениепротивоопухолевогс действия ковалентносвязанной с декстраном нуклегзы 5 Е т,ъагс ее се па.а). Получение ковалентно-связанной сдекстраном нуклеазы Бег. загсе сеьи изучение ее стабильности.120 мг м-аминобензиноксиметиндекстрана, содержание азота О 7%, растворяют на холоду в 1 мн 0,5 н. раствора НС 1. К полученному раствору добавляют 30 мгМаЫО . Диазотйрование проводят в тече-ние 5 мин. Добавляют 0,06 мл ЙаОН(3,5 и,), доводя рН реакционной смеси до3-4, К раствору образовавшегося диазодекстрана при постоянном перемешивании730690 йриливают 25 мл раствора фермента в0,2 М трис-НС 1 буфере рН 8,5. Общееколичество добавленного белка 97,5 мг.Реакционную смесь оставляют на 10-14 чпри 20 С и спустя указанное время отдеоляют ковалентно связанную с декстраномнуклеазу от непрореагировавших декстранаи фермента гельфильтрацией на сефадекси-75 или Я, уравновешенных фосфатным буфером рН 7,2 0,05 М,Стабильность связанной с декстраномнуклеазы проверяют прогреванием при60 С в течение 30 мин, а также обработкой мочевиной в конечной концентрации2 М и 4 М (контакт с мочевиной 30 минс последующим ее удалением диализом против фосфатногобуфера в течение 1,5 сут,).Термостабильность связанного фермента, выражаемая процентом сохранения активности после 30 мин прогрева, состав 2ляет 66% (для нативного 10%).После обработки 2 М мочевиной сохраняется 94% активности связанного фермента (пля нативного 45%), после обработки 4 М мочевиной сохраняется 42%(для нативного 10%),Связанная с декстраном нуклеаза хранится в растворе в течение 1,5 месяцевпри 10-15 ОС без потери активности,тогда как нативный фермент в этих условияхтеряет 50% активности,Связанная с декстраном нуклеаза сохраняется в питательной среде культуры ткани около недели без потери активности,тогда как нативный фермент теряет активность полностью в течение 1-2 сут,(в зависимости от исходной концентрации)Введенный в брюшную полость мышей,зараженных асцитной формой карциномыЭрлиха, нативный фермент исчезает полностью в течение 3-4 ч, тогда как связанный - 12-24 ч.б) Изучение противоопухолевого действия связанной с декстраном нуклеазы,Таблица 1 Фермент Асцит 0 связан ная де Кар цин ан в/м ма Эрлха аркома 37 в/ 8 Асцитнаяр щю Карпин ома 2 Исхоый ме 0 Сар а 37 в ение проводится мышей: асц и соли воопухолеваятывается поидентичногония для кати обилизовая рядом крДанные нативного и нуклеазы пр противоопухолевого действия а двух перевивных опухолях тпой форме карциномы Эрлий форме саркомы 37. Прото.активность препаратов учисле окончания курса лечения, по позам и способамвведевного и соответственно имного ферментов, и оцениваетитериев,противоопухолевой активности модифицированного препаративедены в табл. 1,м-Аминобензилоксиметилпекстран в количествах, содержащиХся в препарате ковалентно связанной с декстраном нуклеазыпротивоопухолевым действием не обладает.Проведенные исследования показывают,что биологическая активность нуклеазы,Зопроявляющаяся наличием у нее противоопухолевого действия, значительно возрастаетпосле связывания фермента с растворимымдекстраном,Пример 2 Пно связанной сАс 1 Хптойоз идейс твия.а) Способ получения ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы и из 40учение ее стабильности,1 1, 0 г м-аминобензилоксим етилпекстрана растворяютна холоду в 100 мл 0,5 н.НС 1, К полученному раствору добавляют400 мг НаМО . Диазотирование проводятв течении 5 мин, Добавляют 3 мл ЙаОН(3,5 н.), доводят рН реакционной смесидо 3,0, К раствору образовавшегося диазодекстрана при постоянном перемешива 50нпи приливают 7,5 мл раствора рибонуклеазы в 0,4 М трис-буфере рН 8,5 (общееколичество добавленного фермента 1,0 г).Реакционную смесь оставляют на 10-14 чпри 20 С и спустя указанное время отде 55ляют ковалентно связанную с пекстраном фрибонуклеазы от непрореагировавших дестрана и фермента гельфильтрацией на сефадексе-75 или 6-100, уравновешенных фосфатным буфером рН 7,2 0,05 М,Нативный ферментИммобилизованный фермент 200000 40 210000 20 Составитель А. БочаровРедактор В, Зарванская Техред М, Кузьма Корректор Е. Папп Заказ 1449/7 Тираж 495Подписное ПН ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж 35; Раушская наб., д, 4/5филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4 9 7306Стабильность связанной с декстраном рибонуклеазы проверяют прогреванием при 60 С в течение 30 мин а также обработ.окой мочевиной в конечной концентрации 6. М (контакт с мочевиной 30 мин с ПО- следующим ее удалением против фосфатного буфера в течение 1,5 сут.).Термостабильность связанного фермента, выражаемая процентом сохранения ак 1 тивности после 30 мин прогрева состав лает 54% (для нативного 6-20%), в зависимости от времени исследования фермента после растворения. У свежерастворенного фермента термостабильность около 20%, у хранившегося после растворения 15 в замороженном виде или при 4 С в течении 1,5-2,0 сут. термостабильность снижается до 3-6%.После обработки 6 М мочевиной сохраняется 56-60% активности связанного ро фермента (для нативного 22%).б) Изучение противовирусного действия связанной с декстраном рибонуклеазы,Противовирусную активность изучают яа вирусе ящура штамм А 22, адаптиро ванном к белым, беспородным мышам, ЖБ вотных заражают внутривенным введением вируса в дозе 100 ЕЭ после чего сразу же начинают курс лечения нативным и параллельно иммобилизованным фермента ми. Ферменты вводят дважды в сутки. Противовирусное действие оценивается в процентах выживщих. животных. Результа ты исследования приведены в табл. 2,Таблица 2 35 90 10Из приведенных данных следует, что биологическая активность рибонуклеазы Ас 1,гиооць, проявляющаяся в ее противовирусном действии, после иммобилизации декстраном существенно возрастает. м-Аминобензилоксиметилдекстран в ко личестве, соответствующем его содержанию в препарате ковалентно связанной с декстраном рибонуклеазы, противовирусным действием не обладает. формула изобретения 1, Способ получения иммобилизованнык нуклеаз посредством их связывания с растворимой матрицей, о т л и ч а ю щ ий - с я тем, что, с целью усилении биологической активности нуклеаз с сохранением их иньекционной формы, используют нуклеазы, выделенные из организмов, фи. логенетически удаленных от организма- мишени, которые ковалентно связывают методом диазосочетания с м-аминобензЩ: оксиметилдексчраном.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что для иммобилизации нуклеаз используют м-аминобензилоксиметилдекстран с мол.вес. 40000-60000. Источники информациипринятые во внимание при экспертизе1. Диксон М Уэбб Эферменты,фМирф, 1966, с, 19,2, Кестнер А, И. Успехи химии. 1974,т. Х, вып.8. 3. Т. М. 8 . СЬсвц,йсйц-Е, 1971,229, % 5280, р. 117.4, ИФРеь ХЯ. Эапц.Р. 1.И,ч М О