Способ получения полипептидов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 08,12.77(51) М. Кл, С 07 б 7/026 Гасударственный немнтет Совете Иииистрее СССР не делам изобретений и открытий(088.8) Иностранцы Гарольд Грегори и Питер Лесли Волтон(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ Изобретение относится к получению лекарственных препаратов, которые могут быть исполь.зованы при лечении диабета.Известен способ получения полипептида дес- Ала э О - свиного инсулина, заключающийся в том, что свиной инсулин подвергают действию энзима карбоксипентидазы с последующим выделением целевого продукта 11) .Однако введение инсулина, полученного таким способом, вызывает антигенную реакцию у больных 1 О диабетом. Целью изобретения является снижение образования антител в организме пациента.Это достигается тем, что обработку свиного или 15 бычьего инсулина осуществляют ферментами АМ - протеаэой из грибка Агю 11 аг 1 а гпе 11 еа или Миксобактер 2 - 1 протеазой ТГ из штамма МухоЬастег А 2 - 1,Свиной или бычий инсулин подвергают дей. 20 сгнию специфической амино - эндопептидаэы лизина с помощью фермента, растворенного в волной сре.де, или с помощью энэина, присоединенного к носителю, который может быть растворим или не растворим в водной среде. 25 Скорость и степень реакции зависит от соотношения фермент - субстрат, рН и температуры инку. бационной среды, концентрации инсулина и време. ии инкубации,Протекание реакции регулируют с помощью проверочных отборов проб реакционной среды или с помощью электрофореэа или отделением на автоматическом аминокислотном анализаторе и легко определяют окончательное отщепление лнзил - аланина и влияние любого видоизменения условий реакции. При использовании фермента АМ - протеазы реакция протекает при широком многообразии со. отношений энэим - субстрат и можно использовать 1 ч энзима на 10000 ч субстрата. Реакция протекает при рН среды 3 - 10 и температуре 10 - 60 С.Предпочтительными условиями реакции для полного отщепления лиэил - аланнна, например, за 3 - 12 час являются: использование концентраций инсулина, близких к их растворимости в инкуба. ционной среде, рН 7 - 9, температура 30 - 50 С н низкое соотношение энэима-субстрата (1:1000 или менее). В инкубационную среду включают ионы металлов, например, кальция или магния н50 виде их хлоридов при концентрации 10 - 10(молярной).При использовивн фермента МиксобактерА 1. - 1 протеазой 11 условия реакции пвти такиеже, которые используют с АМ - протеазой. Соотношение энэим - субстрат 1:10000 прн рН 4 - 10 итемпературе 25-75 С.Предпочтительными условиями являются сле.дующие; концентрация инсулина, близкая к егорастворимости в инкубаторной среде, рН 6 - 9, температура 30 - 50 С и низкое соотношение энэим -субстрат, например 1:1000 или менее.В инкубационную среду вкл 1 очают металлические ионы, например, кальция или магния.Реакцию осуществляют при использовании энзима, связанного ковалентно с подложкой. Однимнэ способов присоединения АМ - протеазы к под.ложке является активирование шариков агарозногогеля цианогенбромидом с пространственными группами (или без них), происходящими, например, иэмксиламина или гексановой кислоты. Затем активированную агарозу подвергают взаимодействию сАМ - п роте азой.Если реакцию с энзимом осуществляют припомощи энзима растворенного и воднйнеобходимый дес - Лиз" - Ала - свиной (или бы.чий) инсулин можно отделять от других компонен.тов инкубационной смеси при помощи любогообщепринятого технологического приема разделе.ния полипептндов, например техники молекулярных сит. Водную среду, оставшуюся после того каквесь нсходныи инсулин деградировал, фильтруютче;аз колонку иэ попергчно-связанного декстрано.вого геля или пслиакриламидного геля, подходящих для фракционирования соединений с мол,в.5000 - 10000 при любом удобном значении рН, пред.почтительно удаленных от полипептидов и предпочвтельно с бс;з.с низкой изоэлектрической точкой,Колонку элюируют буферной смесью, состоящей иэкомпонентов, которые являются летучими присушке вымораживанием под высоким вакуумом,например водной уксусной кислоты, карбоната аммония или ацетата аммония, давая требуемый проЛукт, который отделяют прн сушке выморажива.вием элюата,оЕсли реакцию с энзимом осуществляют с помощью энзима, присоединенного к подложке, тоотделение требуемого полиаептида от энзима осуществляют фильтрованием, если подложка является нерастворимой, илн используют фильтр длявысших полимеров, если подложка является раст.воримой в водной среде.Лаже в кристаллизоаанном свином или бычьеминсулине содержатся другие полипептиды в качестве примесей. Зти примеси обычно присутствуют вколичестве 3 - 5 весЯ от всего инсулина и состоятиз таких веществ, как про-инсулин, фрагментыпро- инсулина и глюкатон, которые трудно отдели.мы от инсулина, Под действием специфическойаминоэн;1 оиеналаэы лизина примеси разрушаются 5 0 15 29 25 ЗО 35 4 О 45 до более мелких полипептидов. Инкубацией свиного или бь 1 чьеьо инсулина со специфической амнноэндопептидазой и отделением продукта, полу. ченного иэ энзима, лизил - аланина и полипептидаз с меньшим молекулярным весом, чем инсулин, т.е, олигопептидов, получают продукт, соде ржащий меньшие количества примесей, чем было в исход. ном препарате, Примеси, присутствующие в инсулиновом грепарате, способствуют его антигенности.Продукты и полипептиды, полученные по пред. лагаемому способу, имеют активность, подобную инсулину, а также вызывают малое количество антител, которые связывают вещества, подобные инсулину при последующем введении в организм, чем исходные вещества.Полученные полипептиды не обладают каким - либо токсическим действием.Их используют для лечения диабета, также как прн.использовании свиного или бычьего инсулина. Назначают их парзнтерально, обычно подкожно или в виде раствора, или в виде препаратов, предназна. ченных для хранения, Препараты оказывают продолжительное действие, например до 24 час. Дозы выбирают в зависимости от требуемого лечения диабета, они могут быть вьюокимн, например 200 ед. ежедневно.П р и м е р 1, Свиной инсулий, который предварительно был перекристаллизован 10 раз, растворяют в 0,1 М бикарбоната аммония (1,0 мл). Раствор инкубируют с АМ - протеазой (50 мкг) в течение 16 час при 37 С.Одну дозу (10 мкг) инкубационной смеси затем анализируют на й . концевые амино - кислоты с помощью приема "дансилирования" при использовании 1 - диметиламинафталин - 5 сулвфонилхлорида.Вторую дозу проверяют с помощью бумажного электрофореза в смеси уксусной и муравьиной кислот при рН 2,1 (20 мл муравьиной кислоты 80 мл уксусной кислоты, разбавленных до 1 л водой) и показывают присутствие Н - Лиэ - Ала - ОН и еще одного компонента. Злюирование второго компонента и анализ й . концевых аминокислот обна. руживает глицин и феннлалании.Общий анализ аминокислот дает общее соотношение аминокислот аспарагиновой кислоты 3, серина 3, треонина 2, глютаминовой кислоты 7, проли. на 1, глицина 4, аланина 1, валина 4, иэолейцина 2, лейцина 6, фенилаланина 3, тирозина 4, гистидина 2 и аргинина 1 вместе с цистеииом количество которое точно не определено. Соединение отличается от свиного инсулина отсутствием в нем лизина и только одного остатка аланина.Третью дозу помещают в верхнюю часть колон. ки из смолы амино-кислотного анализатора Ло0 карта. Колонку из смолы элюируют при 55 С следующим образом: домин (рН 3,28); 55 мин (рН 4,25),2 час 15 мин (рН 6,65), на которой инсулин появляется через 3 час 54 мин, Лиз - Ала через 4 час 15 мин и лес - Лиз" - Ала свиной инсулин через3 час 43 мин. Обнаружены только два пика, соответствующие дес - ЛизАла" - свиному инсулину и Лиз - Ала.Остаток инкубационной смеси помещают на ко.лонку из пористого поперечно-связанного декстра.нового геля, уравновешенного 0,1 моля карбоната аммония. Колонку проявляют 0,1 М карбонатомаммония при скорости потока 3 мл/час и собирают фракции 30 капель (1 мл) . Фракцию анализируют ца пептидный материал измерение м УФ - поглоще.ния при 280 им и фракции 25 - 35, содержащие ос.новной пик, сочетают и лиофилизируют, давая дас.Лиз . Ала - свиной инсулин.П р и м е р 2, Свиной инсулин, перекристаллиэовыванный 10 раз, растворяют в 0,1 М бикарбона та аммония, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх 10 ф молярной концентрации. Порции этого раствора затем инкубируют при рН 8,2 при температуре 37 С в течение 40 час с количест. 20 вом АМ - протеазы, дающим следующие соотношения энзим - субстрат: 1:625,. 1:1250, .1;2500 и 1;5000, Анализ инкубационных смесей с некоторыми интервалами с помощью приемов, описанных в примере 1, показывает полное расщепление в 25 каждом случае, эа исключением 1:5000 реакции, в которой в конце эксперимента получают 88% - ное расщепление.П р и м е р 3. Свиной инсулин, перекристалли.зованный 10 раз, растворяют в буферных смесях, 30 приготовленных из аммиака и уксусной кислоты с рН 4,0; 6,0; 8,0 и 10, содержащих хлористый кальций, давая 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх 1 б" молярной концентрации. Растворы инкубируют с АМ - протеазой при соотношении эн эим - субстрат 1:100 при температуре 37 С в течение 6 час. Анализ показывает, что в каждом случае имеет место расщепление.П р и м е р 4. Свиной инсулин, предварительно перекристаллизованный 10 раз, растворяют в О, М 4 О буферном растворе бикарбоната аммония нри рН 8,2, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх 10 молярной концентрации. Порции раствора .инкубируют с АМ - протеазой при соотношении знзим - субстрат 1:1000 в течение 3 час при температуре 23, 37, 45 и 55 С. Анализ, аналогичный примеру 2, показывает полное расщепление при 37 и 45 С, приблизительно 50%.ное расщепление при 55 С и в небольшой степени расщепление при 23 С.П р и м е р 5, Раствор свиного инсулина (120 мг - кристаллизованный один раз свиной инсулин, очищенный с помощью гелевой фильтрации в 0,1 М карбоната аммония) в воде (14 мл), доведенный до рН 8,0 и содержащий хлористьп кальций в Зх 04 молярной концентрации, инкубируют при 37 С с АМ - протеаэой (120 мкг) в течение 5 час. Во время инкуоации р поддерживают 8,0 с помощью добав ления 0,005 М раствора гидроокиси натрия, олучен.ный раствор помещают иа колонку из пористого поперечно - связанного декстранона о геля и колон. ку проявляют 0,1 М карбонатом аммония при ско. рости потока 13 мл/час при температуре 4 С. Фрак. цию по 150 капель (5 мл) собирают и анализируют на пептидный материал измерением их УФ-погло. щения при 280 нм. Фракции (22 - 30), содержащие главный пик, собирают и лиофилиэируют, давая де - Лиз -Ала - свиной инсулин (100 мг). После электрофореза с помощью полиакриламид. ного геля при рН 8,9 материал представляет собой единственный компонент при окрашивании амидочерным. Он имеет подвижность по направлению к аноду 1,2 относительно подвижности свиного инсувна. Он также дает некоторые интегральные амино - кислотные соотношения (найденные в примере 1).П р и м е р б, Раствор свиного инсулина (1 мг) в 0,1 М буферной смеси бикарбоната аммония с рН 8,2 (1 мл) помешают на верхнюю часть колонки, содержащей 3 мл 4% - ного агарозного геля, к кото.рому ковалентно присоединяют 5 мг АМ-протеазы и уравновешивают в том же самом буферном растворе бикарбоната аммония при 22 С.Колонку элюируют буферным раствором бикарбоната аммония при скорости потока 7 мл/час в течение 1 час и фракцию анализируют на пептидный материал пу. тем измерения УФ - поглощения при 280 нм. Фракции, содержащие пептидный материал, собирают и лиофилизируют, давая дес - Лиз - Ала - свиной инсулин, имеющий те же физические свойства, что и продукт примера 5.П р и м е р 7. Растворы свиного инсулина (кристаллизованные 10 раз), содержащие 1 мг ян. сулина на 1 мг растворителя, инкубирутот при рН 8,0 и температуре 40 С в течение 2 час с АМ - протеазой при соотношении энэим-субстрат 1:000 в присутствии хлористого магния прн концентрациях 10, 16, 10 и 10 молярных соответственно. Анализ, как в примере 2, показывает 90% - ное расщепление с 10 молярной концентрацией Мо, 75% ное расщепление с 1 б и 10молярным Мо и 65 о - ное расщепление с 10 молярным Мо. При отсутствии магния имеет место 68 с - ное расщепление.П р и м е р 8, Раствор кристаллического бычьего инсулина (150 мг) в воде (20 мл), доведенной до рН 8,3 и содержащий 10 М хлористый кальций, инкубируют с АМ - протеазой (240 мкг) в течение 3 час при 37 С.Во время инкубирования рН поддерживают при 8,3 путем добавления 0,02 М раствора гидроокиси натрия, Дозу раствора (10 мкг) проверяют при использовании амино - кислотного анализатора, как описано в примере 1, 1 мин (рН 3,28); 1 мин (рН 4,25),60 мин (рН 6,65), затем цикл регенерании на колонке. Пик инсулина (элюирование в течение 90 мин) отсутствует, тогда как дес - Лиэ - Адазо зо - бычин инсулин (время элюирования 80 мин и Ала - Ала (элюированне в течение 120 мин) лрисут. ствуют. Инкубированный раствор зател лиофилизи.559653 Составитель С МалютинаТехред М. Левицкая КоРРектоР М. Демчнк Ьдактор А. Бер Тираж 553 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж. Раушская наб., и. 4/5Заказ 1426/6 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 руют н твердое вещество растворяют в М уксусной кислоте (2 мл), Этот раствор подвергают гелевой фильтрации при 4 С с М уксусной кислотой в качестве растворителя. Фракции, включанйцие глав. ньй пик, нзмеренкьй с помощью адсорбции УФ при 280 нм, объединяют н модифицируют, давая дес - Дизза -Алазо-бычий инсулин (113 мг). После полиакриламнд-гелевого электро форе за (рН 8,9) материал выглядит как единственный компонент, когда окрашивается амидо-черным, Он имеет подвижность 1-2-кратную подвижности бычьего инсулина по направлению к аноду,Общий амино - кислотный анализ дает те же самые интегральные соотношения аминокислот, что и бычий инсулин, за исключением того, что отсут ствует лизин и только два остатка аланина.Глицин и фенилаланин обнаруживаются как Й- концевые аминокислоты при приеме "дансилирова ния", описанном в примере 1.П р и и е р 9. Один раз кристаллизованньй свиной инсулин (150 мг) растворяют в воде при добавлении И гидроокиси аммония и раствор разбавляют до 3,0 мл 0,1 М бнкарбонатом аммония. Добавляют раствор АМ - протеазы (150 мкг, 0,5 мл) и раствор выдерживают при температуре 37 С в течение 11 час, Анализ дозы перевара с помощью приема, описанного в примере 8, показывает, что переваривание завершилось, Раствор разбавляют 40 об %/об водной уксусной кислоты (3 мл) и полученньй раствор помещают на колонку "Сефадекс" Ю - 50, Колонку элюируют 20 об %/об водной уксусной кислотой и элюат проверяют прн измерении абсорбции 2 Ф при 280 нм. Собирают фракцию иэ 800 капель со скоростью потока 15 ил/час. Инсулиновьй пик появляется между фракциями 45-56, эти фракции обьединяют и су. шат, получают дес - Лиэфф - Алао - свиной инсулин (135 мг) . При этих условиях АМ - протеаза, меченая 1 - 125, появляется между фракциями 36 - 43,Формула изобретения Способ получения полипептндов из инсулинапутем его обработки пентидазой с последующимвыделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й .20 с я тем, что, с целью повышения качества прелара.та, обработку .осуществляют ферментами АМ - протеазой иэ грибка Агпт 11 аг 1 а МеИев или Миксобак.тер 2 1 лротеазой 11 из штамма МухоЬастегАс,Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе:1. Патент США Ие 3,364,116, кл. 424 - 178, 1968,