Способ определения трипсина в дуоденальном содержимом

(55 6 01 К 33/68 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКочу СВИаЕТЕЛЬСтВУ(56) Богер. М,М, Метожелудочной железы, 1982, с. 90-92,овершенствовани В. Гайсенко, Т,В. Ванко, Н.А, Ироденко иисследования подовосибирск: Наука,Изобретение относится к медицине. а именно к биохимической диагностике хронического панкреатита на основании определения активности трипсина в дуоденальном содержимом,Известен способ исследования трипсина в дуоденальном содержимом Бальцера и Вернера, основанный на определении количества щелочи, нейтрализующей продукты, образующиеся при ферментативном расщеплении каэеина дуоденальн ым соком.Однако титриметрическое определение количества щелочи связано с неточностями, что делает метод недостаточно воспроизводимым,Известен также метод определения трипсина в дуоденальном содержимом по Кунитцу в модификации М,П. Черникова, основанный на определении степени триптического гидролиза казеина по поглощению в ультрафиолетовом свете продуктов гидро- лиза, не осажденных ТХУ кислотой. Данная методика трудоемка, требует применения специального оборудования (сосудов для проведения энзиматической реакции спект(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПСИНА В ДУОДЕНАЛЬНОМ СОДЕРЖИМОМ, (57) Использование: медицина,. биохимическая диагностика хронического панкреатита. Сущность. изобретения: готовят несколько проб с различным разведением,. в качестве субстрата используют фибриноген с последук)щим добавлением тромбина. Концентрацию трипсина определяют по. пробе, в которой впервые появился вибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем, 3 табл,рофотометра), недостаточно точна и воспроизводима, Активность трипсина при этом выражена в условных единицах,Известен способ определения трипсина в дуоденальном содержимом, основанный на расщеплении трипсином синтетического субстрата й-бензоил О-аргинин-пара-нитроанилина (БАПНА) в модификации В.А, Шатерникова, касающийся применения вместо трис-буфера веронало- Ь вого буфера,аавйОднако определение трипсина данным С методом связано с трудностями, т.к; уста- Я) новление концентрации пара-нитроанили- д на в мутном дуоденальном содержимом часто невозможно. Рекомендуемая В.А. Шатерниковым концентрация веронала близка к насыщенному раствору, врезультате чего веронал легко выпадает в осадок, придавая мутность раствору, что также затрудняет фотометрию. Кроме того. фотометрия на двух волнах сопряжена с неточностями. Поэтому, несмотря на специфичность субстрата (БАПНА), воспроизводимость и точность метода определения трипсина недостаточна, Недостатком является также и то, что активность фермента в этом методе выражается в условных единицах.Целью изобретения является повышение точности способа.Указанная цель достигается тем, что в качестве субстрата-белка используют фибриноген с последующим добавлением тромбина, а концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем.Способ осуществляют следующим образом,Реактивы: 1) 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0; 2) фибриноген 100 мг растворить в 10 мл фосфатного буфера рН 7,0 при 37 С, добавляя по частям рэстворитель; 3) соевый ингибитор трипсина 8,5 мг растворить в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, в 2 раза разбавленного 0,15 М раствором йаС; 4) тромбин 10 мг растворить в 2 мл 0,15 М КаС, отцентрифугировэть и разбавить еще в 5 раз 0,15 М МаС; 5) дуоденальное содержимое отцентрифугировать и разбавить базальный секрет в 20 раз и брать в тест в количестве от 0,05 до 0,025 мл, стимулированный секрет - в 50 раз и брать в тест в количестве от 0,1 до 0,025 мл.Оборудование: водяная баня,Постановка теста, В 8 пробирок вносят по 0,5 мл раствора фибриногена и разведенное базальное дуоденальное содержимое в количестве 0,05; 0,04; 0.03 и 0,025 мл; стимулированное дуоденальное содержимое в количестве 0,1; 0,075; 0,05 и 0,025 мл, Затем пробирки ставят в водяную баню.при 37 С на 15 мин, после чего вносят по 0.1 мл соевого ингибитора трипсинэ, держат на холоде в течение 10 мин и добавляют по 0,1 мл раствора тромбина, помещают на 30 мин в водяную баню при 37 С. После этого осуществляют визуальное наблюдение,В опытах с модельными системами (вместо дуоденального содержимого вносились различные количества кристаллического трипсина) установлено, что критическая концентрация трипсина, при которой выпадает мельчайшая фибриновая муть, составляет 0,8 мкг/мл. Таким образом, учитывая разведение дуоденального содержимого. можно рассчитать концентрацию трипсина.Например, базальный секрет был разбавлен в 20 раз, В тест взяты следующие количества: 0,05; 0,04; 0,03 и 0,025 мл При 0.03 мл появилэсь фибриновэя муть, что соответствует 0 8 мкг, В 0,03 мл исходного дуоденального содержимого содержится 0,8 20 = =16 мкг, а в 1 мл 533 мкг, Следовательно, концентрация трипсина в исследуемом дуоденальном содержимом составляет 533 мкг/мл.П р и м е р 1. Больная Пдиагноз:хронический панкреэтит, хронический гаст родуоденит, Активность трипсина в базальной порции дуоденального содержимого составила 400 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,04 10 мл разведенного дуоденального содержимого). Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (дуоденальное содержимое разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произош ло при внесении 0,05 мл разведенного дуоденального содержимого) составила 800 мкг/мл,П р и м е р 2. Больной Мдиагноз;хронический холецистит, хронический гаст родуоденит. Активность трипсина в базальной порции дуоденального содержимого составила 533 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,03 25 мл дуоденального содержимого), Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (1 кд/кг массы тела внутривенно струйно) составила 1600 мкг/мл (дуоденальное содержимое 30 разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,025 мл разведенного дуоденал ьного содержимого),По, предлагаемому способу проведено100 исследований активности трипсина в 35 дуоденальном содержимом. Приводятся данные, характеризующие воспроизводимость полученных результатов предлагаемым методом и прототипом..Воспроизводимость результатов оцени вали с помощью коэффициента вариации:о Ч= - 100%; х=хх и 45 где х - результат отдельного определения;х - средняя арифметическая; 50 и - числоопределения; Я - среднеквадратическое отклонение, При исследовании образца дуоденального содержимого предложенным методом определена активность трипсина, мкг/мл; 55 При исследовании образца дуоденального содержимого методом прототипа пол учены результаты, представленные в табл.2.Таким образом, из приведенных данныхвидно, что точность (воспроизводимость)35390 292 28 784 31436 3 34424576 37 50 50 5 56 х олжение та л; = 28,6; предлагаемого метода выше, чем прототипа,Статическим критерием правильности является степень отклонения средней арифметической от должного значения, Для определения правильности предлагаемого метода использован способ добавки - внесения в биологическую жидкость точно взвешенного количества анализируемого вещества и определения его с помощью исследуемого метода, Для этого в пробирку внесено 10 мг кристаллического трипсина, добавлено 10 мл 0,15 М йаС 1. При этом получен раствор трипсина концентрации 1000 мкг/мл, Результаты определения активности трипсина в данной пробе предлагаемым методом представлены в табл.З,Процент отклонения от заданной величкзадин. веич. - ктич, вел.задан, велич,)1000-960,- 100 % =4%. Таким образом,отклонение от заданной величины составляет всего 4%,Предлагаемый способ определениятрипсина в дуоденальном.содержимом по 5 зволяет получать результаты с достаточнойвоспроизводимостью. Способ достаточнопрост, доступен, может быть широко использован в профильных учреждениях и нетребует применения дефицитных реакти 10 вов, специальной аппаратуры.Формула изобретенияСпособ определения трипсина в дуоденальном содержимом путем взятия пробы,ее разведения, инкубации с субстратом и15 оценки результатов, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точности способа готовят несколько проб с различнымразведением, в качестве субстрата используют фибриноген с последующим,цабавле 20. нием тромбина, а концентрацию трипсинаопределяют по пробе, в которой впервыепоявился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем,1741081 Таблица 3 10 Показатели Продолжение табл. 3. Составитель Н.ТеренинаТехред М,Моргентал Корректор А.Ротман Редактор М,Циткина Заказ 2083 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва,Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 хв х-х х-х 1000 40 1600