Способ консервирования рекомбинантного штамма рsеudомоnаs species продуцента -2 интерферона

(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии(56) ЯЬагр Р.Я, ТЬе Ргезегча 1 оп оГОепефсаИу Опз 1 аЫе Мсгоогцапзщз апб тпеСгуоргезегуабоп оГ Ееггпептабоп Зевам Сцвцгез,Аб) апсез п Вогесбпоорса 1 Ргосеззез, 1984,М.З, р. 81,Реферон сухой для истерство медицинской иской промышленности),(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНтНОГО ШТАММА РЯЕиООМОЙАЯ ЯРЕС 1 ЕЯ - ПРОДУЦЕНТА а -2 ИНТЕРЭЕРОНА чъекций (Цини- микробиологичеВильнюс, НПО Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для хранения генноинженерных штаммов,Цель изобретенля - повышение выхода -2 интерферона,Сущность изобретения заключается втом, .что для продуцентов иинтерферона- рекомбинантных штаммов Рзецбоглопаззресез, есть оптимальная точка консервации культур - 15 - 30 мин после достижениямаксимальной скорости роста для длительного хранения в жидкой среде с 15%-нымглицеринам и антибиотиками в замороженном состоянии и ри (-70) - (-196)С, способствующая повышению выхода рекомбинант 2 впо ГОСУДЛРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗО 6 РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫГИЯМПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относитсяк биотехнологии и может быть использовано для хранения генноинженерных штаммов. С целью повышения выхода а -2 интерферона для продуцентов а -2 интерферона - рекомбинантных штаммов Рзецбогпопаз зр. установлена оптимальная точка консервации культур 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста для хранения в замороженном состоянии при -(70) - (-196)С в жидкой среде с 15%-ным глицерином и антибиотиками, Предлагаемый способ разработки для продуцента а -2 интерферона - Рзецдощопаз зр. Ч 6-84,несущего плазмиду Чб(депонирован во ВНИИгенетика), а также ряда других штаммов-и родуце нтов рекомбина нтного а интерферона, позволяет повысить выход этого вещества после 1,5 лет хранения в 0,5-1,74 раза в поледующих ферментациях по сравнению с; звестным способом, 1 ил.,7 2 табл,ного интерферона;- следующих ферментациях,П р и м е р 1, Приготавливают для ферментера "Возга 1 Е" фирмы "В.Вгацп 1 Ме 1 зцпцеп" емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л питательную среду (10 л) следующего состава, г/л: гидролизат казеина (Ф С - 42 - 632 - 72 М РТУ 42) 120 мл/л; гидролизат пекарских доожжей 5; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 1,5; калий фосфооноклслый однозамещенный 0,6; аммоний серчокислый 3; натрий хлористый 0,5; магний сернокислый семиводный 0,25: кальций хлсристый 0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15.1 л этой среды разливают в 4 х 250 качалочные колбы и засевают (по 1 л) жидкозаконсервированной культурой Рзедс)ощопаззресез, несущей плэзмиду рЧ 6-3 (штэммдепонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики), Колбыпомещают на 20 - 22 ч в термостатирующиекачалки при 30 - 35 С, Полученным инокулятом засевают ферменту,Ферментацию проводят при 30 - 35 С,; рН среды поддерживают автоматически нэуровне 7,0 - 7,1, пеногашение на уровне датчика, р 02 изменяют по Динамике роста от 40до 70до насыщения.Каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности и определенияскорости роста клетокгде Х(к), Х(к) - оптическая плотность в моменты времени.Полученное значение скорости ростабактерий Ч(к) сравнивают с предыдущимзначением Ч(к), Спустя 15 - ЗО мин послеудовлетворения условию Ч - Ч(-1)О культуру готовят к консервированию,Для этого в стерильных условиях центрифугируют 400 мл культуральной среды.,осадок клеток ресуспендируют в 200 мл свежей среде указанного состава, добавляютантибиотики и 200 мл стерильного раствора 15;4-ного глицерина, Полученную суспензию клеток разливают по 1 мл вгластмассовые пробирки типа Эппендорфемкостью 1,5 мл. Емкость с пробиркамипомещают в холодильник глубокого ох.лаждения при -20 С на 22-24 ч, а потомперемещают в кельвинэтор и хранят притемпературе (-7075) - (-19 б)С в течение1,5 года.Динамику биосинтеза рекомбинэнтного аинтерферона определяют иммуннымметодом.Результаты экспериментальных исследований приведены в табл,1 и.отображенына чертеже, где нэ графике 5 исходного варианта отмечены цифрами в крукках точкиконсервирования, Консерванты, полученные в этих точках, были использованы для осуществления четырех ферментаций, которые в табл,1 обозначены соответствующимиваоиантами.Из экспериментальных данных, пред 5 ставленных на чертеже и в табл,1, следует,что по сравнению с исходной ферментацией в последующих ферментациях 1-4 биосинтетические свойства повышаются. Во2-м варианте, где консервация осуществле 10 на при максимальной скорости роста, выходпродукта повышается на 7;(, а в 3-м вариант, где консервация произведена через ЗОмин после достижения максимальной скорости роста, - нэ 20 ,15 П р и м е р 2. Результаты обработкиэкспериментальных данных, приведенныев табл.2, показывают, что предлагаемыйспособ консервации рекомбинантногоштамма Рзеобощопав зрес 1 ез И 3-84 - про 20 дуцента аинтерферонэ, позволяет повысить выход продукта по сравнению сизвестным в 1,74 раза.Предлагаемый способ пригоден длядругих штаммов Рзецбогпопаз зр, - проду 25 центов рекомбинантного интерферона а -2.а именно штамм ауксотроф по аденину, другие двэ - по треонину, Каждый штамм обладает специфически обработаннымиплазмидами. Активность рекомбинантного30 интерферона а -2 в ферментэциях, засеянных культурами; законсервированнымипо предлагаемому способу, ппвышается в0,5-1 74 раза по сравнению с известнымспособом,35 Формула изобретенияСпособ консервирования рекомбинантного штамма Рзецоопопаз зрес)ев 40 продуцентэ а -2 интерферона, предусматривающий отделение свежевыращенныхклеток путем их центрифугирования, ресуспендирование осадка в свежей среде сглицерином и антибиотиками, консервиро 45 вание в стеклянных или пастмассовых ампулах и хранение при -(70) - (-196) С, о т л ич э ю щ и й с я тем, что, с целью повышениявыхода интерферона, консервированиеосуществляют через 15 - ЗО мин после того,50 как скорость роста достигает своего максимального значения,с)8 8 Таблица 1-й вариант ВариИсходный вариант О 1 О О, 029 0,064 0,066 0,075 0,091 0,083 0,016 О, 1)36 0,033 2,2 1,83 3,32 4,35 3,67 3,2 3,6 3,3 2,0 П р и м е ц а н и е. с - время;Х - концентрация микроорганизмов (бактерий);) - скорость роста бактерий;,1)ЧР - концентрацияС 6-г интерерова. Продолжение табл,1 О 1,25 1,5 2,12 2,5 4,25 3 6,5 0,871,93,75,5 01 3 6,0 3,5 8,37 4 11,6 4,5 13,0 5 14,5 5,5 16,0 3,54 г,4,9,212,75 4,67З,О 2,1,25 08 16,17,16,5 16,2 264 аблица Фермента ци о и е агаемом спосо о известном спосо Максимальная активность из культуры, законсервированной в середине экспонентной фазы роста,х 10 МЕ/л Максимальная активность из культуры, законсервированной 15 - 30 мин спустя послемаксимальной скоростиоста х 10 МЕ/л 1 2 3 4,72 4,65 4,0 4,57 2,2 3,3 2,5 3,5 875 4 11,25 4,5 14,5" 5 14,5 5,5 15,25 6 15,5 0 0,56 2 1,31 3 3,5 4 625 5 11,6 5,5 14,5 б 15,6 6,25 15,9 7 17,4 7,5 17,4 8 1715 0,009 0,035 0,075 0,075 0,083 0,108 0,006 0,036 0,045 0,089 0,096 0,036 0,020 0,033 0 -0008 О,ОЧ 0,030 О 060 0,066 0,054 0,121 0,058 0,075 0,008 0 ) Я 1 1 1,41 2,5 4,07 3 6,) 35 8,0 4 10,25 ,5 1 З,О 5 15,5 55 16,0 6 17, 6,5 18,1 0,017 0,050 0,079 0,107 0,056 0,050 0,050 О, 016 -0,0111698285 1 Х едак га ктоР И Уу Заказ 4367 Тираж Г 1 одписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва. )К, Раушская наб 4/5