Способ получения иммобилизованной формиатдегидрогеназы

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЯОБИЛИЗОВАН -НОИ ФОРМИАТ 11 ГГИДРОГЕНАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именнок способам иммобилизации формиатдегидрогеназы. Цельизобретения - повышение выхода иммобилиэованной формиатдегидрогеназы поактивности. Способ заключается виммобилизации фермента на носителе,предварительно обработанном глутаровым альдегидом. Иммобилизацию проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и конкурентных по формиату ингибиторовфермента. Молярное соотношение фермента и НАД 1:(2-215), концентрацияингибитора равна 12, 3-1430 константам ингибирования. Для увеличениястабильности иммобилизованную формиатдегидрогеназу обрабатывают боргидридом натрия. Выход фермента возрастает с 27 до 56-777 Баха,чно"Фервичюс,о,ундис СССР 1985.зависи- илотрофтв и ста обилизоя, 1977-,Способ заключае нкубации йермента минированным носи тся в том, что при иотех получения дегидрогенаидрогеназы измов, котоана как и касается способа лизованной формиат частности формиатг тройных микроорга иммозы,мети м глутаровым ал ионную смесь доп и конкурентные по ту ингибиторы фер фермент - никотиотид окисленнный мен о акт тношению к йорми ента. Соотношени регенерацластях би системы а составная койактора технологи личных о ком орг ническом си ой диагноснамидадениндинук- тозе,едицинс гибитор устанавливают 1:2 добавляют в конце.21,3-1430 констан Выход целевого пр ти возрастает при 55 - 773. 215, а итра ции,ам ингиб эе, анал вно ике,трования.активнос+51 до вышение выхоатдегидрогективности. Цель изда иммобилнаэы по фе ния - пной формтивной укта п том от ван ент ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Авторское свидетельство1326616, кл. С 12 И 11/00,Родионов Ю.В. и др. НАД -мая формиатдегидрогеназа метных бактерий. Изучение свойсбильности растворимого и иммванного ферментов. - Биохимит. 42,11, с, 2020-2026. эобретение относится я может быть использо с нерастворимыыелем, активированегидом, в инкубанительно вводят3 14795Способ иллюстрируется следующимипримерами осуществления.П р и м е р 1. 250 мг аминированного силохрома С/70 инкубируютв 2 мл дистиллированной воды при90 С в течение 30 мин. Далее силохром промывают 50 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,0 и инкубируютпри постоянном перемешивании с 10 мл2,5 -ного раствора глутарового диальдегида в том же буфе 1 е. Обработанный альдегидом силохром отмывают отнесвязавшегося глутарового альдегидана стеклянном Фильтре 500 мл О, 1 Ифосфатного буфера, рН 7,8 и 50 мл0,1 М фосфатного буфера рН 7,0. Котмытому силохрому добавляют 3 млраствора формиатдегидрогеназы(10 мМ) и 1 РО мкл раствора аэиданатрия (6,510 " И, К; " 10 М) (молярное соотношение фермент - НАД -азидсоставляет 1:215) и инкубируют припостоянном перемешивании в течение3 ч при 25 С. Несвязавшийся ферментсмывают 40 мл раствора 3 М формиатав О, 1 М фосфатном буфере, рН 7, 8.В результате иммобилизации к силохрому присоединяется 80 белка, .которыесохраняют 60 активности,П р и м е р 2. Иммобилизацию Формиатдегидрогеназы проводят согласнопримеру 1. Полученный катализаторообрабатывают при охлаждении,(4 С) 353 мл раствора боргидрида натрия(10 мг/мл) в О, 2 М фосфатном буфере,рН 7,8. Удельная активность иммобилиэованной Формиатдегидрогеназы послеобработки боргидридом не изменяется.Обработка боргидридом приводит к повьпиению стабильности иммобилиэованных ферментных препаратов при пониженных ( 7,0) значениях рН. Прихранении иммобилизованной формиатдегидрогенаэы, полученной согласно примеру 1, в буферном растворе с рН7,0 в течение 4 мес, при 4 С наблюдается десорбция до 30 белка. Дляпрепаратов иммобилизованного фермента, обработанных боргидридом натрия,в тех же условиях весь белок остается связанным с сорбентом,П р и м е р 3. Осуществляют попримеру 1, но вместо азида натрия 55.берут 20 мкл раствора нитрита натрия(01 И 1 ,. 451 С М) В результате при и.илобилизации концентрацияингибитора составляет 12,3 К, а к 14силохрому присоединяется 83 белка, который сохраняет 55 активности.П р и м е р 4. Способ осуществля ют по примеру 1, но НАД добавляют в концентрации 1, 1 1 С" М, а 100 мкл аэнда натрия берут из раствора в концентрации 5 1 С М (соотношение фермент-НАД составляет 1:20, концентрация ингибитора 1430 1 К;). В результате иммобилизации к силохрому присоединяется 80 белка, которые сохраняют 56 активности.П р и м е р 5, Отличающийся от примера 1 тем, что в качестве сорбента используют аминогексилсефарозу, 2 г носителя инкубируют в течение 4 ч в 50 мл 2,5 -ного водного раство" ра глутарового альдегида при 20 С. Далее носитель отмывают на фильтре О, 5 л 3 И КС 1, О, 5 л дистиллирован- . ной воды и 0,5 л 0,2 М К-Фосфатного буФера, рН 7,0. Затем модифицированный носитель инкубируют с раствором Формиатдегидрогенаэы (4 мл. 1 мг/мл) в 0,2 М К-фосфатном. буфере, рН 7,0 при встряхивании на качалке в течение 3 ч при 25 С. Иммобилизацию проводят в присутствии НАД (2 мМ) и азида натрия (10 И). Молярное соотношение фермент - НАД равно 1:164, а концентрация ингибитора 1000 К;. По окончании процесса иммобилизации носитель отмывают на фильтре 100 мл 3 М НС 1, 100 мл 3 М формиата натрия, 0,5 л 0,2 М К-фосфатного буфера, рН 7,0, В результате при иммобилизации сохраняется 77 . Ферментативной активности.П р:и м е р 6. Способ осуществляют по примеру 3, но концентрация нитрита в реакционной смеси составляет 0,2 М (444 К;). К силохрому присоединяется 86 белка, который сохраняет 60 активности.П р и м е р 7. Способ осуществляют по примеру 6, но иммобилиэацию проводят в присутствии 1,5 М хлорида натрия. К носителю присоединяется 87 . белка, который сохраняет 58 активности.П р и м е р 8. Способ осуществляют по примеру 1, но вместо азида используют роданид в концентрации 610-М (К; = 1,11 СМ, концентрация = 55 К;). К носителю присоединяется 90 фермента, который сохраняет 57 активности.14 14795 ляет получать биоорганические катализаторы на основе формиатдегидрогеназы, обладающие высокой активностью,и приводит к уменьшению расхода фермента. Восстановление лабильнойазометиновой связи боргидридом препятствует десорбции фермента с носителя в процессе эксплуатации иповышает его операционную стабиль"ность. Формула изобретения Составитель В.МуронецТехред М.Ходанич Корректор А.Обручар Редактор М.Недолуженко Заказ 2504/25 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 511 р и м е р 9. Способ осуществля ют по примеру 1, но вместо азида используют цианат натрия (К= 2х 10 фМ) в концентрации 2 10М (100 К,). К силохрому присоединяется5 85 г фермента, который сохраняет 607 активности.П р и м е р 10. Способ осуществляют по примеру 1, но концентрация10 формиатдегидрогенаэы в растворе составляет 5 мг/л (6,2 10М), НАД 1,2 1 О М, азид 5 10 М (соотношение фермент - НАД 1:2),Концентрация ингибитора равна 500 К., К силохрому присоединяется 777. фермента, который сохраняет 587 активности.П р и м е р 11. Способ осуществляют по примеру 1, но концентрация формиатдегидрогеназы в растворе составляет 5 мг/мл, концентрация НАД 10 М, азида 1,4 10-М (соотношение концентраций фермент -НАД 1: 16, концентрация ингибитора 1400 К;); К силохрому присоединяется 80% фермента, который сохраняет 567 активности.Преимущество предлагаемого способа иммобилизации формиатдегидрогеназы заключается в том, что благодаря присутствию в реакционной смеси специфических защитных агентов процесс иммобилизации протекает с минимальными потерями активности, что позвоСпособ получения иммобилиэованной формиатдегидрогеназы, включающий инкубирование фермента в буферном растворе с нерастворимым аминированным носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, и отмывание носителя от несвяэавшегося фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта по ферментативной активности, инкубирование фермента проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида и конкурентных в отношении формиата ингибиторов фермента, устанавливая при этом молярное соотношение ферментникотинамидадениндинуклеотид окисленный, равным 1:2-215 и концентрацию ингибитора, равной 12, 3 - 1430 константам ингибирования.