Способ получения меченого белка

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЕЧЕННОГО БЕЛК ника регист к улуцаенченного бело соединебота э-за их роме то именение адиацион- аболемолекулу ям структуры ти к измене сти.ниятия и, которые опа, обуссть, и. Метотопа .в молеко известны ов изотопами щимися у-ис" в белок и углеро- лучедение радиоактивногоют либо непосредствентные остатки белка,атицеские группы, либофикацией различных реов белка специальнымиержащими изотопы иода. При этом вв иода осуществл но в аминокисл содержащие аро химической мод акционных цент реагентами, со Изобретение относится ному способу полуцения ме ка, биологически активног ния, которое может найти в биологии и медицине для ной диагностики различных ваний,Известны меценные. белк различаются природой изот лавливающего радиоактивно дами введения данного иэо кулу белка. Наиболее аиро способы промецивания белк иода - 125,). и,1313 б являюточниками Г 1 1 и 2. отт, Ю.А. Семин, б.б. Домбровский, А.И. уверенны С,О. Вязов и Н,В. Дороаенко .Й;. овательский институт медицинской радиолбтии=. АМН СССР Несмотря на то, что т рации -излучения проста изотопами иода неудобна лого периода полуспада. вклюцение иода в белкову 5 часто приводит к нарушен молекулы белка, в частно нию антигенной специйичн Известны способы введ долгоживущих изотопов тр да, обладающих .мягкимНапример, описан способ получениярадиоактивного препарата белка реак цией восстановительного алкилированияс использованием .".4 с-аормальдегида.По этому способу на первой стадии реакции происходит взаимодействие йормальдегида с 6"аииногруппами, лизинабелка с образованием лабильных оснований Вифф. Вторая стадия реакции заключается в восстановлении лабильныхоснований Ниффа, до стабильных метиль6ны, во-первых, блокированием большого числа Е -аминогрупп белка, а во-вторых способностью боргидрида и цианборгидрида натрия восстанавливать не только основания ЙиФфа, но и карбоксильные группы, сульФидные связи, определяющие стабильность конФормации белка.Целью изобретения является повышение удельной радиоактивности промечиваемого .белка при сохранении,его антигенной специФичности.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения меченОного белка с помощью Формальдегида, заключающемуся в том, что Формальдегид подвергают взаимодействию с алифатической аминокислотой, меценной тритием или углеродом, и образующимся при этом производным общей Фор- мулы ЪЭтот способ. позволяет проводить реакцию восстановления при нейтральных значениях рН и широком температурном интервале (от 0 оГ до 37 оС),что позволяет расширить номенклатуру белков, способных к промациванию при указанных режимах обработки4 1.35Известные способы обработки белков реакцией восстановительного алкилирования с использованием в качестве восстанавливающих агентов боргидрида и цианборгидрида натрия дают возможность получать меченные белки, сохраняющие антигенную специйичность, с удельной радиоактивностью 0,4-9,0 мкК/ /г белка, которая, однако,часто недостаточна для тестирования микроколи 45 честв белка, с которыми приходится иметь дело в биохимических исследованиях. Вследствие того, что радиоактивность меченного препарата определяется количеством "С-Формальдегида, необратимо связанного с аминогруппами белка, данный метод не позволяет получать препараты с большей удельной радиоактивностью, чем указано выше, без нарудения антигенной специФицности белка, Изменения в структуре белка при использовании значительных количеств Формальдегида и, особенно, , восстанавливающих агентов, обусловле 96803 ных групп при помощи боргидрида натрия. Обработка белков данным способом осуществляется при рН близком к 9,0 в температуре около 0 С31,Недостатком метода является узкий диапазон значений рН и теслпературы обработки белка, связанный с неустой- чивостью боргидрида натрия. При помо" щи метода восстановительного алкилиро-. вания с использованием боргидрида нато рия можно промечивать только ограниченный круг белков, стабильных именно при данных строгих параметрах обработки.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения меченных тритием или углеродом 14 белков, который состоит в обработке белка радиоктивным Формальдегидом с последующис. восстановлением образующихся лабильных оснований Пибйа до стабильных соединений цианоборгидридом натрия 1ЮР НН - СН Ое --- 5-Н =СНТ.2 ТИОЬНЗСН Ф2 Н а СНТ Б НН СНЬ где Р- Н;Н " алкил или "4 С-алкил,обрабатывают белок в водном буФерномрастворе при рН 5,5-10,0 и температуре 20"48 С, при молярном соотношениикомпонентов Формальдегида, аминокислоты и белка 0,045-0,060:1,9 х 102.4 х 10 З:10 -10 2.Предпочтительными вариантами проведения процесса являются использование в качестве водного буФерного раствора фосФатного и боратного буФеров;в качестве алиФатической аминокислоты используют ЗН-лизин, Н-глицин3ф 1 С-.лейцин.Предлагаемый способ позволяет получить белок с удельной радиоактивностью 120-909 слкК/мг белка.Антигенная специФичность белка,промеченных путем восстановительногоалкилирования в указанных концентрационных параметрах Формальдегида ивосстановителя, также практически неизменяется.Однако нельзя получить более высокопромеченные препараты белков методомвосстановительного алкилирования Форм"альдегида без серьезного нарушенияантигенной специФичности.Для экономного расходования радиоактивных аминокислот, белков и прочихматериалов важное знацение имеет возможность получения высокопромеченныхбелков с заданной удельной радиоактивностью путем варьирования удельной36 бничиваются областью устойчивости каждого конкретного белка.Меченный белок отделяют от низкомолекулярных компонентов элюированиемчерез хроматографическую колонку с се-.фадексом или посредством диализа.Удельную радиоактивность белка опре- .деляют нанесением пробы объемом0,02 мл на мембранный Фильтр "Сын"пор" с последующим просчитываниемр-излучения и толуольном ацинтилляторе на сцинтилляционном счетчике.П р и м е р 1, Для получения меченного тритием человеческого миогло":бина взято на 1 мг белка 10,0 мК моно-.гидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 40,0 К/мМ и радиоактивнойконцентрации 1,0 мК/мл. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20 С. Врезультате промечивания получен белокс удельной радиоактивностью450,0 мкК/мг. Титр меченного белкаво встречном электроосмошорезе составлял 1:256, титр нативного бел.ка 1:256.П р и м е р ы 2 и 3. Для получениясравнительных данных по влиянию наудельную радиоактивность человеческо"го миоглобина удельной радиоактивности и концентрации используемой аминокислоты, взято на 1 мг белка 10,0 мКмоногидрохлорида Н-лизина удельнойрадиоактивности соответственно40,0 К/мМ и;0,25 К/мМ с радиоактивНой концентрацией в обоих случаях,0 мК/мп. Режим обработки: рН 7,9,и температура.37 ОС. В результате промечивания получены белки с удельнойрадиоактивностью соответственно617,0 мкк/мг и 175,0 мкК/мг. Титрымеченных белков в обоих случаях вовстречном электроосмофорезе. составляли. 1:256, титр исходного белка также1:256.П р и м е р 4. Яля получениямеченного тритием бычьего сывороточного альбумина взято на 1 мг белка10,0 мК моногидрохлорида Н-лизинаудельной радиоактивности 40,0 К/мМи радиоактивной концентрации 1,0 мК//мл. Режим обработки: рН 5,5 и температура 25 фС. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 273,0 мкК/мг Титр меченного белка в реакции нейтрализацииантител составлял 1.4096, титр исходного белка 1:4096,П р и м е р 5. Для получения меченного углеродомбычьего сыворо 5 9680радиоактивности или концентрации аминокислот 1,.фиг. 1 и пример 2,3).Из табл, 2 также видно, что с увеличением температуры возрастает удельная радиоактивность промечюваемого збелка. Однако для каждого конкретногобелка имеется верхний предел температурного режима обработки, связанныйс денатурационными процессами,Установлено, что существует определенное значение рН, зависящее от,природы конкретного белка, при котором удельная радиоактивность промечи-ваемого предлагаемым способом белкадостигает максимального значения 15(фиг. 2).На фиг. 1 представлена зависимостьвеличины удельной радиоактивностимиоглобина, промеченного предлагаемымспособом, от концентрации используемой радиоактивной аминокислоты, вчастности моногидрохлорида Н-лизина;.на фиг. 2 - зависимость величиныудельной радиоактивности ( а ) миоглобина и (б )бычьего сывороточного альбумина, меченных предлагаемым способом, от величины рН среды..способа промечивания белков обеспечивает возможность создания ряда оте- Э 0чественных комплектов препаратов длярадиоизотопного анализа в биохимических и в медицинских исследованиях,например для диагностики инфарктамиокарда и т.д.Общая схема получения меченногобелка. К 0,1 мл раствора радиоактивной коммерческой алифатической аминокис 40 лоты требуемой удельной радиоактивности или концентрации добавляют последовательно 0,01 мл 0,9-1,2 И раст рора Формальдегида (оптимально 1,12 М)л 0,1 мл раствора белка концентрации 0,08-0,20 мг/мл. Реакцию белка с4 рабильными производными Формальдегида и алифатической аминокислоты, образующимся практически мгновенно при их смешении, проводят в течение 4 сут так как за это время, согласно кине-. тическим измерениям, взаимодействие практически заканчивается. Процесс промечивания проводят при соответствующем значении рН от 5,5 до 10,0 задаваемым в области рН 8,0-10,0 боратным буфером, а в области 5,5-8,0 Фосфатным буфером, и температуре 20-48 ОС. Режим обработки рН и температура ограТаблица 1 Режим промечивания Белок Пример ее ее ее и иТС рн ее6 -"- 48 90 40 0 10,0 П р и и е ч а н и е. Числитель - удельная радиоактивность, К/мМ.Знаменатель - радиоактивная проба,мК/мг белка,7 968036 8точного альбумина взято на 1 мг бел,0 мК моногидрохлорида Н-лизина ка 10,0 мК 4 С-лейцина удельной радио- удельной радиоактивности 40,0 к/мМ активности 54,0 Кlмй и радиоактивной и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ концентрации 1,0 мК/мл. Режим обра- /мл. Режим обработки: рН 9,0 и темпеботки: рН 9,0 и температура 37 фС. й ратура 48 С, В результате промечива- В результате промечивания полученния получен белок с удельной радио- белок с удельной радиоактивностью активностью 909,0 мкК/мл. Титр мечен,0 мкК/мг. Титр меченного белка в ного белка в реакции нейтрализации реакции нейтрализации антител состав- антител составлял 1:4096, титр исходлял 1;4096, титр нативного белка 1 ф ного белка 1:4096.1:4096. В .приведенных табл. 1 и 2 даныП р и м е р 6, Фя получения ме- конкретные примеры составления реценного по тритию бычьего сывороточ- акционньх смесей для получения меченного альбумина взято на 1 мг белка ного белка,.968036 Табли ц а 2 Удельная радио- Титр белкаактивность белка, мкК/мг Прифлер Белок 1:128 Челове-,ческиймиоглобинИзвестный Нативный бе 1:256 То же лок 450,0 1: 256 1;256 617,0 1;256 175,0 Известный 1:4096 Бычий сывороточный альбуфлин 1:4096 Нативный То жебелок 1:4096 1:4096 1:4096 273,0 291,0 909 0 П р и м е р 7. Получение меченного человеческого миоглобина при использовании формальдегида с концентрацией меньшей нижнего предела.Для получения меченного тритием человеческого миоглобина взято на 1 кг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-ли 3зина удельной радиоактивности 40,0 К/45 /мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ил, при этом концентрация белка в пробе составляла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20 С. Концентрация используемого формальдегида 0,04 М. В результате промечива 30 ния в течение 4 сут получен белок с удельной радиоактивностью 280 мкК/мг, в течение 8 сут 320 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электро" осмойорезе составлял 1,256, титр нативного белка - 1:256.Пр и м е р 8. Получение меценно го бычьего сывороточного альбумина при использовании формальдегида с концентрацией больней верхнего пределаДля получения меченного тритием. бычьего сывороточного альбумина взято на 1 кгбелка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 40,0 К/АМ .и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл, при этом концентрация белка в пробе составляла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 5,6., температура 25 ОГ. Концентрация используемого формальдегида 0,08 М, В результате промечивания в течение 2 сут получен белок с удельной радиоактивностью 120 мкК/мг, в течение 4 сут 270 мкК/мг. Титр меченного бел-. ка в реакции нейтрализации антител составляет: через 2 сут ийкубации 1: 2048, через 4 сут - 1:1024,. Титр нативного белка - 1: М 96.П р и м е р 9. Использование Н-глицина в качестве меченной аминокислоты.что полученные результаты сопоставле"ны (табл, 3).В табл. 3 приведены результаты параллельного радиоиммунологическогоопределения уровня миоглобина в сыворотках больных инФарктом миокарда,полученные при использовании 1-миоглобина (Бог 1 п 81 оюед 1 са, Италия) иН-миоглобина, .промеченного предлагаемым способом,ТаблицаУровень миоглобинав сыворотках больныхинйарктом миокарда,"75 Больной Ц,859 302 192 Больной Г. Формула изобретения1, Способ получения меченного бел ка с помощью Формальдегида, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной радиоактивности белка при сохранении его антигенной специФичности, Формальдегид подвергают взаимодействию с алиФатической аминокислотой, меченной тритием, или,углеродоми образующимся при этом производным общей ФормулыЯ - СН-СООН111 - СН где Ю - Н;Н - алнил или "4 С-алкил,11 968036 12Для получения меценного тритиемчеловеческого миоглобина взято на 1 мг,белка 12,5 мК,Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл, при 3 этом концентрация белка в .пробе составляла 8,0 мкг. Режим обработки: рН 8,0 и температура 37 ОС. В результате промечивания полуцен белок с удельной радиоактивностью 310 мкК/мг. 10 Титр меченного белка во встречном электроосмоФорезе составлял 1:256, титр нативного белка: 1:256. Меченный миоглоП р и м е р 10. Использование бинН-глицина в качестве меченной амина кислотыДля получения меченного тритием человеческого ииоглобина взято на 1 мг белка 5,0 мМ Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактив ной концентрации 11,0 мК/мл при этом Здоровый донор 15-85 концентрация белка составляла 20,0 мкг в пробе Режим обработки: рН 8,0 и Больной К. 259 температуре 37 ОС. В результате промечивания получен белок с удельной 2 з Больной И. 671 радиоактивностью 130 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электро- Больной Л, осмоФорезе составлял 1:526, титр нативного белка - 1:256, 3111Сохранность антигенной специФич- з 0 ности человеческого миоглобина прове рена во встречном электроосмойорезе, сохранность антигенной специФичности Больной Б, бычьего,сывороточного альбумина проверена в реакции нейтрализации анти тел.Данные табл. 2 показывают, что по Больная О. 871 сравнению с известным способом значительно увеличивается удельная радио- Больная Д,активность белков, промеченных Пред лагаемым способом, что позволяет про 215 водить биохимические и медицинские исследования с меньшими концентрациями белков. Так получен Н-миоглобин высокой3 удельной радиоактивности без нарушения его антигенной специФицности. На основе этого препарата метод радиоиммунологического определения уровня миоглабина в сыворотках позволяет определять миоглобин в концентрации не менее 15 х 10 г/мл.В результате параллельного определения уровня миоглобина в сыворотках больных и здоровых людей с помом 5щью импортного набора (5 ог 1 п В 1 опе" 61 са, Италия) и с помощью описываемой методики, где меченным антигеномйлЬЪ ь 139680обрабатывают белок в водном буферномрастворе при рН 5,5-10,0 и температуре 20-48 С при молярном соотношенииоформальдегида, аминокислоты и белка0,045-0,060:1,9 х 10-4 х 10 :11 ГО .2. Способ по и. 1, о т л и ц а -ю щ и й с я тем, цто в качестве водногобуФерного раствбра используют фосфатный и боратный буферы.3. Способ по и, 1, о т л и ц а ю Вщ и й с я тем, цто в кацестве алифатицеской аминокислоты используют ЗН-лизин, Н-глицин и "4 Г"лейцин,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. ВоРоп А,Е., Нипсег Ч.М. ТЬеРаЬеРР,п 1 о 1 ргоСепз Со 1 дЬзрес 1 Ес гадоасчйез Ьу сопцдайоп 36 14 .йо а 125,1-сопйаипд асуРайпд адепт.АррРсайоп со тпе гад 1 огвпцпоазвау.Востен. 1973, 133,3 5292, Сгеепиоод Г.С., Нипйег 1.И. ТЬергерагайоп оГ 1311-РаЬеРРед Ьцщап дгоцЮ Ьогюопе оГ и.дЬ пресГс гадоассчед, ВосЬею. Д. 1963, 89 М114. 3. Рсе К,Н., Яеапз С.Е. Радоас 1 че РаЬеРРпп оЮ ргоСеи и чйГо,. Во 1. СЬел,1971, 246, Г 4 3, 331.4 Рой;агоагйи О., ЙачеЙ Л.И.ВадоРаЬеИпд от ргойепз Ьу гедцсСче аРсуРайоп иСЬ ГфС-ЕогщаИе"Ьус 1 е апд водцп суапоЬогоЬудгдеАпаР. ВосЬеп, 1978, 87, М 2, с. 562.дписное а СССтийаб.д тная Составитель В. Вол Редактор Г. Волкова Техред М, Коштура Заказ 02573 Тираж 3 ВВНИИПИ Государственного. комите по делам иэобретений и откр 11303 Москва Н-Я Раушская филиал ППП "Патейт"., г, Ужгород,