Способ получения калиевой соли l-молочной кислоты

-28231,ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биохимии МГУ им. М.В. Ломоно(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛИЕВОЙ СОЛИЬ-МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а именно к получению Ь-молочной кислоты биотрансформацией фумаровой кислоты, которая может быть использована для 5 получения лекарственных препараторов, медицинских полимеров и химических катализаторов.Цель изобретения - улучшение качества целевого продукта и повышение 10 выхода Ь-молочной кислоты.Способ заключается в том, что проводят биотрансформацию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН, взятого в эквимолярном отношении к фумаровой кислоте, под действием соиммобилизованных в каррагинановом геле клеток ЬассоЬас 11 ия(57) Изобретение относится к тонкомубиотехнологическому синтезу, а именно к получению Ь-молочной кислоты,которая может быть использована дляполучения лекарственных препаратов,медицинских полимеров и химическихкатализаторов. Целью изобретенияявляется улучшение качества целевого продукта и повышение выхода Ь-молочной кислоты. Способ заключаетсяв том, что проводят биотрансформацию фумаровой кислоты в присутствииводного раствора КОН под действиемсоиммобилизованных в каррагинановомгеле клеток ЬасоЬас 111 ия саяе 1 ВКМВи ЕясЬег 1 с 111 а со 1 ВКПМ В,причем клетки Е.со 1 предварительноактивируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. 1 табл. 2саяе 1 ВКМ Ви Еясйег 1 сЬ 1 а со 11 ВКПМ В, причем клетки Е.со 11 предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпирцциния.Культивирование Ь. саяе 1 ВКМ Введут на стандартной питательной среде содержащей пептон, глюкозу, дрожжевой автолизат, добавки минеральных солей и Ь-яблочной кислоты, в течение 19 ч при 37 С и рН 6,0.Полученную биомассу отделяют от гитательной среды, например, цеитрифугированием, клетки отмывают от питательной среды.Культивирование Е.со 11 ВКПМ Введут на бульоне Хоттингера, содержащем добавки НаС 1, рН 7,0, в течение 24 ч при 30 С при перемешивании.аПолученную биомассу отделяют от питательной среды, например, центри" фугированием, отмывают от питательной среды и активируют раствором фума" рата калия, содержащим 0,02% бромистого цетилпиридиния, в течение 20 чопри 30 С. По окончании активации клетки Е.со 1 ВКПМ В"4024 отделяют центрифугированием, отмывают и проводят их соиммобилизацию с Ь.сазед ВКМ Вв 5%-ном каррагинановом геле.Соотношение клеток Е.со 11 ВКПМ Ви Ь.сазед ВКМ Вна единицу объема биокатализатора определяют соотношением активностей исходных компонентов биокатализатора: фумаразной активности, клеток Е.со 1 ВКПМ Ви малолактик-активности клеток Ь. сазе 1 ВКМ В. Фумаразную активность клеток Е.со 11 ВКПМ Вопределяют спектрофотометрически по убыли фумарата, активность малолактик-фермента в Ь, сазе 1 ВКМ Вопределяют по накоплению Ь-лактата.Для выбранных штаммов соотношение удельной активности клеток Е.со 11 ВКПМ Ви Ь,сазе 1 ВКМ Всоставляет 10:1, подсчет клеток осуществляют в камере Горяева, 1 мл суспен.и зии,Ь. сазе 1 ВКМ Всодержит 2 1 о клеток, 1 мл суспензииЕ.со 1 БКПМ В- 1,5 1 0" клеток, Для соиммобилизации,Е.со 11 ВКПМ Ви Ь. сазех ВКМ Вберут в соотношении числа клеток (клеточном соотношении), равном 1:1-1,5, при таком соотноше- . нии скоростьопределяющей стадией всего процесса является превращение яблочной кислоты в молочную, катализируемое Ь.сазе 1 ВБМ В, Уменьшение количества клеток Ь. сазе 1 ВКМ Вна единицу объема иммобилизованного биокатализатора, которое происходит при изменении клеточного соотношения Е.со 11 ВКПМ Ви Ь. сазе ВКМ Вв сторону увеличения содержания Е.со 11 Вдо 7:1, приводит к снижению скорости всего процесса биотрансформации в целом. При понижении содержания Е. со 11 ВКПМ В - 4024 до клеточного соотношения 1:20 и ниже скороатьимитирующей стадией процесса становится гидратация фумаровой кислоты в яблочную, что также приводит к снижению скорости общего процесса биотрансформации.5 10 15 20 2530404550 фата магния, 0,005% сульфата марганца, 0,05% Р,Ь - цистеина, 0,1% Тыееп 80,рН среды доводят гидроокисью калиядо 6,0, Клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение20 мин, Клетки дважды отмывают отпитательной среды 0,1 М Иа-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 и 55 Гель с соиммобилизованными клетками обрабатывают водным раствором, содержащим фумаровую кислоту и гицроокись калия в эквимолярном соотношении, при этом часть фумаровой кислоты находится в виде осадка. Количество осадка определяется концентрацией фумаровой кислоты, взятой для биотрансформации. рН раствора составляет 4,5. В кислой среде происходит полное удаление углекислого газа, образующегося в процессе биотрансформации, накопление которого в растворе при щелочной реакции среды ингибирует процесс и понижает степень конверсии субстрата. Именно кислая реакция среды обеспечивает необратимость декарбоксилирования яблочной кислоты в молочную и тем самым способствует сдвигу равновесия гидратации фумаровой кислоты в яблочную в сторону полной конверсии фумаровай кислоты в продукты биотрансформации. Использование меньшего количества КОН приводит к значительному закислению реакционной среды вследствиеобразования молочнойкислоты, инактивации биокатализатора и неполной конверсии субстрата в продукт, Эквимолярное соотношение фумаровой кислоты и гидроокиси калия обеспечивает образование лактата калия с выходом 100% и не содержащего свободной молочной кислоты.Процесс биотрансформации ведут при 37 С, так как этот температурный режим является оптимальным дляобеих использованных культур микроорганизмов, относящихся к группемезофиловП р .и м е р 1. Культивирование клеток бактерии ЬасеоЬас 11 из сазе ВКМ В, полученной из Всесоюзной коллекции микроорганизмов и описанной как ЬасТоЬас 1.11 цз сазе 1 С 37, осуществляют в течение 1 6 ч при 37 С на стандартной среде, содержашей 5%дрожжевого ав толиз а та, О, 5% Ь-яб - лочной кислоты, 1% глюкозы, 5% пептона, 0,3% ацетата натрия, 0,02% суль14548 Способ получения калиевой соли Ь-молочной кислоты путем биотрансформации нерастворимого в воде субстрата с помощью двух культур микроорганизмов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта и повышения выхода, в качестве культур микроорганизмов используют штамм ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 11 ВКПМ В, активированный бромистым цетилпиридинием, и штамм ЬасгоЬаса 1- 1 ця саяе 1 ВК 11 В, соиммобилизованные в каррагинатовый гель в клеточном соотношении 1:1-1,5, а в качестве субстрата - фумаровую кислоту, при этом биотрансформацию ведут в присутствии гидроокиси калия, добавляемой в эквимолярном соотношении к фумаровой кислоте. осаждают центрифугированием при6000 об/мин в течение 20 мин, Выход биомассы с 0,5 л питательной среды составляет 3,5-4,2 мл суспензии,содержащей 2 1 О клеток намл.Активность клеток 1 саяе 1 ВКМ В в реакции яблочно-молочнокислогоброжения составляет 10 мкмолей/минна 1 мл суспензия. 1 ОКультивирование клеток бактерииЕяс 1 ег 1 сЬ 1 а со 11 ВКПМ В, полученной из коллекции культур кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ и описанной как Евсеегхс 11 а со 11 85, осуществляют на гидролизате бульона Хоттингера, содержащем 0,5 Е хлористого натрия (рН среды равен 7,0) в течение 24 ч при30 С и непрерывном перемешивании на 20качалке со скоростью 160 об/мин.Клетки осаждают центрифугированиемпри 6000 об/мин в течение 20 мин,суспендируют в 0,97,-ном растворехлористого натрия и центрифугируют 25повторно в тех же условиях. Выходбиомассы с 0,5 л питательной средысоставляет 4 мл суспензии с концентрацией клеток 1,510 Я на 1 мл. Фумаразная активность клеток Е.со 1 д 30ВКПМ Всоставляет 100 мкмоль/минна 1 мл суспензии клеток.К 1 мл суспензии клеток Е.со 13.ВКПМ Вдобавляют 25 мл 0,1 Мраствора фумарата натрия и 0,25 мл2 Е-ного раствора бромистого цетилпиридиния. Полученную смесь инкубируют при 30 С в течение 5 ч при слабом перемешивании. По окончании инкубации клетки осаждают центрифу-щгированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, промывают 0,1 М Ба-фосфатным буферным раствором, рН среды 6,0 и повторно центрифугируют.1,5 мл суспензии клеток Е.со 1 45ВКПМ В, предварительно обработанных 0,022-ным раствором бромистого цетилпиридиния, как описано вышее,и Ь,саяе 1 ВКМ В, взятых в клеточном соотношении 1:1 (влияние 50клеточного соотношения на выход продукта представлено в таблице),содержащей приблизительно 6 10 клеток, вносят в 5,5 мл 67,-ного раствора 54 6каррагииана в 0,1 М Иа-фосфатном бу-.,фере рН 6,0 40 С и перемешивают,После охлаждения гель заливают 70 млохлажденного О, М К-фосфатного буФера, рН 6,0. Сформировавшийся гельизмельчают и в течение 1 сут отмывают 0,1 М К-фосфатным буфером,рН 6,0. Соиммобилизованные клетки (7 мл геля) заливают 20 мл реакционной смеси, содержащей 2 ммоль фумаровой кислоты и 2 ммоль гидроокиси калия. Клетки инкубируют в реакционной среде в течение 24 ч при 37 С при слабом перемешивании. Выход молочной кислоты составляет 1007, продуктивность иммобилизованных клеток 1,1 мг/ч на 1 мл биокаталпзатора.П р и м е р 2. Выращивание и соиммобилизацию клеток Е.со 11 ВКПМ Ви Ь. савела ВКМ Восуществляют как в примере 1, В качестве реакционной смеси используют 20 мл водного раствора, содержащего 10 ммоль фумаровой кислоты и 10 ммоль гидрооксида калия7 мл соиммобилизованных клеток заливают реакционнойо смесью и инкубируют 72 ч при 37 С. Выход молочной кислоты 1007, продуктивность иммобилизованных клеток 1,8 мг/ч с 1 мл биокатализатора. Формула изобретения1454854 Соотношение числа клеток Е.со 11,ВКПИ Ви Ь.савела ВКИВ, включенных в гель каррагинана Показатель 1 ф 1,5 1:20 Выход молочной кислоты,Е 54 00 00 Продуктивность, мг/чна 1 мл биокатализатора 0,1 0,6 1, 1,1 Составитель В, Варламов Техред М. ХоданичРедактор Н. Кнштулинец Корректор С. Шекмар Заказ 7411730 Тираж 500 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д 4/5