Способ получения антибиотика ср-63517, используемого в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота и свиней

СОЮЗ СОЮТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИ(19 011 СПУБЛ С 12 Р 1/00 ИОАН ОБРЕТ лтер ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(72) Уолтер Даниэль СелмерПатрик Куллен (11 Я), Хитосии Дзунсуке Тоне (,УР)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА СР, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СВИНЕЙ.(57) Изобретение относитсяк способу получения нового кислотного поли- циклического эфирного антибиотика СР. Целью изобретения являФ- ется повышение эффективности спосо" ба. Способ заключается в следующем: проводят культивирование Я 1 гер 1 ошус епдця, яцЬяр,:ацгецяАТССна питательной среде, содержащей источ ники углерода, азота и неорганичеоские соли, при 24-26 С с последую" щим выделением антибиотика в виде катионной соли общей формулы.1431682 новый антибиотик относится к кислотным полициклическим эфирным (ионофорным) антибиотикам.Целью изобретения является новыйантибиотик, обладающий высокой эффективностью в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота исвиней и имеет химическую формулу,л7 Ойе 65 Н где Ме СНьЕго катионные .соли активны противразличных микроорганизмов и эффективны при борьбе с кокцидозом, энтериТом, дизентерией у свиней и тейлериоФом, а также эффективны для ускорения роста у свиней и жвачных животных, а также для повышения эффективности усвоения пищи свиньями и рогатым скотом.Штамм 81 гер 1 ошусея епйия, яцЬяр,шеця депонирован в Американской кол.лекции типовых культур (АТОС) подномером 39574.оКультуру инкубируют при 28 С и по 40лученные результаты проверяют в различные моменты времени, но обычноспустя 14 дней. Окраску описывают вобычной терминологии, но точныецвета определяют путем сравнения с45цветными пластинами Со 1 ог Нагшопу , Мапца 1 четвертого издания.Для идентификации используют следующие среды.Экстракт трицтон-дрожжевого бульона 1 ЯР ф 1-я среда).50Агар на экстракте дрожжей-экстракте солода (18 Р 2-я среда,Пансо).Агар на отваре из овсяной муки(ОЯР = Зя среда, Васо ) .Агар на смеси неорганические соликрахмал (1 ЯР4-, я среда, ИХсо).Агар на смеси глицерин-аспаратин(1 ЯР, = 5-я среда, Пансо). рожжево я среда р на смеси пепт т-железо (1 ЯРэкстрак МГсо).Сахарозный ар Я.А. Ма о 1 2 среда ап. ЮЬ , с,З ЫпопусеСея61. 0 о-аспарагиновый аг9 2, с. 328.еннета, там же, ср р, там люкоз ред гар 31. да В 30,еда У 28,а, т гар Эме с, 331Питательный агУ 14, с, 330.Тирозиновый агВ. Е. Оогйоп апй69, с. 47- 150 (1Казеиновый агаАгар кальций мяиап, Вас 1. Веч.Желатин - В. Е1.М. МПш,Ю, Вас195 ре м ж и Смита -Вас 1ар Гордона М.М, Стп 11 Ь, 955).р, там же.алата - Я,А.21, 1-29 (195Оогйоп апй73, с. 57 ьон,а ДекстЯ.А. УаКсреда Внием 30розы и б 1, с.г саха ез ага на кар Ьеча 11. й, 71,ра.тофеле и моркови - ег, д, ЬаЬ. апй С 1 дс.934-944 (968), н Агар М.Р, Ье п 3.са 1 М Изобретение относится к способу получения нового антибиотика, обозначенного как СР, который был выделен при ферментации нового штамма рода 81 гергошусея, выделенного из образца почвы, отобранного в префектуре Окаяма в Японии, и которому присвоен кодовый номер В 497-34, Этот 7), рахмал, там же, рганический питательный питательный бульон -ТЬе АсСпошусе 1 ея, чо 1 2 328, 1961, с добавлерозы вместо 3 г декст15 используют только 30 г картофеля,2,5 г моркови и 20 г агара.2 Е-ный агар на водопроводной воде.Снятое молоко - ИРсо.5Продукты переработки целлюлозы:а) Н.Ь. 7 епяеп. Ргос. Ьепп. Бос,Б.БЛ. 55, 231-248 (1930).в) М.Ьеппе апй М.Ч.Бспосп 3.епкомпилляция культуральной среды, 1 Осреда У 2511, 1930.Углеводы - 1 Р, 9-я среда, МРсо.Температурный интервал - 1 Р 2-ясреда плюс 50 мл кокосового молокана литр среды.Морфологические характеристики.Морфмологические характеристикипрослеживают на агаре из овсяной муки после 14 дней инкубирования: масса спор в серыхколористических 20сериях,спорофоры разветвлены моноподно цепи спор спирального малогодиаметра (3-4 мкм), слега открытые,от 3 до 7 поворотов на цепь спор,от 10 до 50 спор на цепь спор, споры 25коротки палочкообразные, иногда глобулярные, овальные или эллиптические,прямые или слегка искривленные, причем некоторые из слегка искривленныхс непараллельными концами и образуют 30пятиугольник 1,0-1,8 ф 0,9-1,2 мкмили 0,9-1,2 мкм диаметром, бородавчатые по данным электронной микроск опииБиохимические характеристики.Меланин не продуцирует, сероводо-род продуцирует, желатин ожижает,крахмал гидролизует, нитрат восстанавливает до нитрита, хороший ростна бульоне на целлюлозе Левина и Шоэнлейна, но плохой рост на бульонена целлюлозе Йенсена, нет разложения на обоих бульонах на целлюлозе,коагулирует и просветляет на молоке, усваивает казеин; усваивает 45малаты, кальций не усваивает тирозин. Усваивает углеводы: глюкозу,арабинозу, фруктозу, инозитол,маннитол, раффинозу, рамноэу, сахарозу и ксилозу. 50Температурная зависимость: 21 С -хороший рост, 28 С - отличный рост,37 С - хороший рост, 45 С - умеренный рост,Новый антибиотик получают ферментацией нового штамма БСгерСошусевепйця. яцйвр, ацгеця АТССиэкстракцией полного бульона при естественном рН метилизобутилкетоном и концентрированием растворителя до получения вязкого масла. Это масло суспендируют в гептане и порциями обрабатывают на силикагеле. Лепешку силикагеля элюируют хлороформом, смесью хлороформ (этилацетат, этилацетатом и смесь этилацетат) ацетат. После концентрирования из этипацетатной фракции получают небольшое количество неочищенного продукта, из которого перекристаллизуют антибиотик СРв виде смеси солей натрия и калия. БСгерСошусев. епйцв,яцЪвр, ацсеця АТССвыращивают при температуре от 24 до 36 С в погруженных условиях при перемешивании и аэрации на .среде, состоящей из таких источников углеводов, как сахара, крахмал, глицерин, таких веществ, содержащих органический азот, как соевая мука, казаминовые кислоты, экстракты дрожжей; из таких ростовых веществ, как растворимые части зерна, рыбная мука, мука хлопковых семян, из минеральных солей, содержащих следовые количества таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк и карбонат кальция или фосфаты в качестве буферирующих агентов. Антибиотик можно выделить экстрагируя полный бульон различными органическими растворителями, например, н-бутанолом, метилизобутилкетоном или хлороформом. Неочищенные формы антибиотика РСили высушенный ферментационный бульон, содержащий антибиотик, можно вводить в кормовые композиции в нужных концентрациях,Пример.Выделение, антибиотика СРиз ферментационного бульона,Полный бульон из 10 сосудов ферментации культруры АТСС(полный объем приблизительно 25 л) экстрагируют половиной объема метилизобутилкетона. Полученный экстракт концентрируют в вакууме до получения коричневого масла (20 г). Этот материал хроматографируют на колонке 5 ф 00 см заполненной силикагелем хроматографической степени чистоты в этилацетате. Колонку проявляют этилацетатом со ско ростью 10 мл/мин. Отбирают фракции по 10 мл. Затем эти фракции исследуют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля с проявителем этилацетатом. Затем пластины опрыскивают 37,-ным ванилином в этано/59 Тираж 520 Подписно ИИПИ Заказ Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная 5 1 ле - 85% фосфорной кислотой (3:1) и нагревают до 80 С. Целевой антибиотИк СРпоявляется в виде зеленого пятна в этих условиях. Фракции, содержащие СР, объединяют (полнйй объем приблизительно 300 мл) и перемешивают с 2 г угля Эагсо С 60" в течение 15 мин. Полученную смесь фильтруют и полученный фильтрат перемешивают с 300 мл 5%-ного натрий"сфатного двухосновного буфера, а р устанавливают 10,0 1 н. ИаОН, Фаз 1 разделяют и этилацетат сушат над б зводным сульфатом натрия, фильтр т и выпаривают в вакууме. Желтое вязкое масло, оставшееся после выпариванияр растворяют в небольшом объ. аде ацетона, после чего происходит кристаллизация.Кристаллы собирают фильтрованием исушат в вакууме, в результате чего получают 809 мг СРв виде натриевой соли, т,пл, 215-220 С,ИК спектр (КВг) см : 3436, 2964, 2928 р 2871, 2728, 1666, 1563, 1462, 1404, 1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205 р 1167 р 1100 р 1050 р 1033 р 995 р 980, 967, 940, 926, 902, 858, 538,Оптическое вращение Ы/Р = +25 (С = 0,5 метанол).Рассчитано, %: С 63,49; Н 8,89; И 0,0,С 47 НО 1 4 Ба Найденор % С 62 р 45 , Н 8 р 61 И 0,0 х 1 С 1. Ашегса р,7 пс. М 1 пппдгоп р 1 ре 1 ачагер 19899.СРв форме свободной кислоты получаютр перемешивая флороформовый раствор СРс :эквивалентным объемом воды и понижая рН до 3,0 фосфорной кислотойфазы разделяют и хлороформ выпаривают в вакууме до получения свободной кислоты СРв виде аморфного твердого вещества с 10 т.пл. 95-105 С, УФ 232 нм,ИК-спектр КВг) см : 3474, 2968,2832, 2877, 1715, 1670, 1460, 1380, 1315, 1265, 1233, 1202, 1165, 1113, 15 1099, 1066 1046 1021 987 950,923, 900.Оптическое вращение: Ы/Р = +47,4(С = 0,5 метанол). 20 Рассчитано, %; С 65,10, Н 9,07 О 25,83. Са 1 Н т 804Найдено, %: С 64,05, Н 8,93 25 О 27,03 .(по разности).Строение СР,подтвержденоданными 1 Н-ЯМР и масспектром высокого разрешения. Способ получения антибиотикаСР, используемого в качествекормовой добавки для крупного рогатого скота и свиней, заключающийсяв культивировании штамма актиномицета АТСС У 39574 на питательнойсреде, содержащей источники углерода,азота и неорганические соли, при 24 Зб С с последующим выделением анти биотика в виде катионной соли общей формулы