Способ получения фосфоэстераз гриба реniсilliuм вrеvi сомрастuм

6,ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЬСТ тельскои медицине целью бол рья за сч кислои и и ФМЭьзования сыо выделения леаз, ФМЭальной жидее полного ис т одновременног елочной рибонук ильтрат культур кости с анионообменного волокнаЦМ-А 2, содержащий фосфомоноэстеразы,концентрируют ультрафильтрацией, подвергают гель-фильтрации на сефадексеСс последующим диализом активных фракций, при хроматографии наКМ-целлюлозе разделяют фракции, со-,держащие ФМЭ, которая выходит всвободном объеме колонки, и фракции,содержащие ФМЭ, элюируемую тем жебуфером с возрастающей до 0,6 М концентрацией раствора хлористого натрия; последующее концентрированиеультрафильтрацией осуществляют раздельно для ФМЭи ФМЭ, затем раствор ФМЭподвергают лиофильной сушке, а раствор ФМЭзамораживают. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Институт биохймии и физиологиимикроорганизмов АН СССР(56) Ильина Т.В., Безбородова С,И,Внеклеточные фосфомоноэстераэы грибов рода Репхсд 11 дцш. - Микробиология, 1973, т Х 1.11; с. 1001,Авторское свидетельство СССРУ 734261, кл. С 12 М 9/22, 1977.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЭСТЕРАЗГРИБА РЕН 1 С 1 Ь 1,1 ПМ ВВЕЧ 7-СОМРАСТ 11 М(57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности, в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ и ФМЭ, кислой и щелочной рибонуклеаз) гриба, используемых в исследова3 Я"(1 ъ-.-: -,ь 3 ,ф Ягд844 У биохимической практике, ви пищевой промышленности. С1402619 Изобретение относится к микробиологической промьштленностиз в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭи ФМЭ, КФЗ 3.1,3.2, кислой и щелочной рибонуклеаз - КФ,31.4,2.2 и 3.1.4.2.3) гриба Реп 1 ст 11 т.цт Ъгечз. - сошрасСцшз используемых в исследовательской биохимической практике и 10 в медицине,Цель изобретения - более полное использование сырья за счет одновременного выделейия кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз 15 1 и 11.Способ заключается в том, что по" лученный в ходе ферментации фильтраткультуральной жидкости гриба Репдсх 1- 1 цш Ьгечд-сотрасцш ВКМ РП под вергают ионообменной хроматографии последовательно на анионите ЭДЭП и анионообменном волокне ЦМ-А 2, на котором сорбируются рибонуклеазы, а фосфомоноэстеразы выходят в свободном объеме. Десорбцию рибонуклеаз с волокна проводят трис-ацетатным буферным раствором с возрастающей от 0 до 0,6 М концентрацией хлористого иатрия. Активные фракции, содержащие 30 рибонуклеазы, нейтрализуют, концентСхема получения ферментов грибаРептсз 1 цця Ьгетт-ссезрассцн ф Культивирование гриба Ралтс 11 Ции Ьгечт-союрассцнОчистка нетканого Растворааниоиите ЭЛЭ Нейтрализация злюатов 2 я,иаОН ог ы Несорбнрованиые на Лй-А 2 волокне фосфомонозстеразиКокцентрмразвияе иа ультрафильтрате с нембраной УАИ ЛиалнзГель-хроиатаграфяя яв 0-100 Элюциа 0,02 трнс-НС 1РН 7,5 ЛиалнзХроматография иа КИ-целлюлозеЭгззцик 0,02 и. трнс-апет,бубером РН 4,Ь, далееградиентом О-О,Ь И в тоние буфереКоицектрнроваиие фИЭ-азн11 яа мвибраяв УАИ Эамораянваиие КаицеитрироваяиеС 41 Э-взм 1 иа мембране УАИ Лиофильиая стека Эюоцих Рйк-аз 0,5 ИНаС 1 в 0,1 И ацетвтион буфере РН 5Нейтрализация 2 н. РвОНКонцентрация на мемОране УАИХронатаграфиа наКИ-целлюлозеЛиализЭюециз граднентон от 0до 1 И НаС 1 в 0,01трис"ацетатнан буферерй 4,5Концентрированиеиа нембраие УАИ Гель-хроматография нагидрорипьтном гелеЭлюцик 0,05 И Элюция 0,05 Игрие-НС 1 РН 7,5 трис-НС 1 РН ),51Коицеитрнрова" Коидентрнроваинеяяа яислой иелочной РНК-азмРНК"взм намам нв мембране УАИ бране УАИ"1 ООЛивлиз против Ляализ против 0,01 Идистнллнрааая- ацегатнага буфераиой води РН З,З Лиофнльв а а Лнофильиа в суикасевнв кристаллов, вьюавииз при диалязе рируют ультрафильтрацией и диализуют,Проводят хроматографию на КМ-целлюлозе, концентрирование активных элюатовультрафильтрацией и гель-хроматографию на гидрофильном геле ЭД,5.Разделенные при гель-хроматографиикислую и щелочную рибонуклеазы концентрируют ультрафильтрацией, диализуют. При диализе щелочной РНК-азывыпадают кристаллы. Отдиализованныйраствор кислой РНК-азы и кристаллыщелочной РНК-азы лиофильно сушат.Несорбированные на анионообменномволокне ЦМ-А 2 фосфомоноэстеразы концентрируют ультрафильтрацией, диализуют и проводят гель-хроматографиюна Сс целью очистки от примесных белков, мешающих разделению двухфосфомоноэстераз на ионообменникеКМ-целлюлозе. Активные фракции, содержащие фосфомоноэстеразы,.диализуюти подвергают хроматографии на КМ-целлюлозе, Полученные ФМЭ-азу 1 иФМЭ-азу 11 концентрируют ультрафильтрацией и,соответственно лиофильно сушат и замораживают, так как ФМЭ-аза 11в процессе лиофильной сушки теряетактивность,Схема получения ферментов грибаРепсх 11 дцш Ьгечд-сотрасйцтп следующая0,2 20 П р и м е р. Исходным посевнымматериалом для получения внеклеточных фосфомоноэстераз служит культураРепдс 1111 цт Ьгеч 1-сошрасСигп ВКМ5РР, растущая на скошенном агаре.Засев партий среды производят воцнойсуспензией конидий. Выращивание посевного материала в маточных колбахпроводят на качалке, делающей О190 об/мин, при 24+1 С в течение 2024 ч на среде следующего состава, Х:Глюкоза 5Пептон 1Аммоний сернокислыйКальций хлористый 0,02Мука соевая 0,5Магний сернокислый 0,05Вода дистиллированная До 1 лПолученную культуру в виде густойвзвеси мицелия используют для засева 25питательной среды в ферментере емкостью 30 л (полезная емкость до20 л). Объем посевного мицелия длязасева ферментера 1 ОЕ от объема среды,возраст 24 ч. Для выращивания посев-. 30ного инокулята Реп 1 с 111 ыш Ьгеч 1-сошрасСцш применяется среда того же состава, что и для проведения ферментации в колбах на качалке, Процесс выращивания посевного материала в ферментере проводят при следующем режиме: температура 24+1 С; расход воздуха 0,6:1 (л/мин по ротаметру); мешалка 200 об/мин; продолжительность24 ч. 40Полученную культуру в виде густойвзвеси мицелия используют для засевапитательной среды в ферментере емкостью 100 л (1 ОЕ к объему засеваемойсреды), Биосинтез фосфоэстераз Реп 1 с 1111 цт Ьгеч 1-сотраспт проводитсяна среде такого же состава, что и длявыращивания посевного материала вферментере (емкостью 30 л) для выращивания инокулята. Ферментацию ведутпри следующих условиях: температурав ферментере 24+1 С; давление 0,20,3; расход воздуха 0,6:1 (л/мин поротаметру); растворенный кислородподдерживается около 207; рН культу-,5ральной жидкости не ниже 3,0; продолжительность ферментаций 72 ч,По окончании ферментации судят посовокупности следующих показателей: повьппение рН культуральной жидкостивьппе 3,0; активность фосфоэстеразмаксимальная; полное исчерпание углеводов.Ферментер охлаждают до 8 С, культуральную жидкость отфильтровывают,нативный раствор после фильтрациидолжен уцовлетворять слецуюшим требоованиям: температура раствора 6-8 С;рН 3,2-3,6; прозрачный,70 л нативного раствора пропускаютчерез колонку с анионитом ЭДЭПсо скоростью 00 л/ч, Элюаты нейтрализуют 2 н. ИаОН при перемешивании дорН 7,0-7,5 и подают на колонку сЦМ-А 2 волокном со скоростью 100 л/ч,На анионообменном волокне П 1-А 2 происходит сорбция РНК-аз, кислые фосфомоноэстеразы проходят через колонку.Десорбцию РНК-аз ведут 0,5 М БаС 1в 0,1 н, ацетатном буфере, рН 5,0.Собирают элюаты по 5 л и определяютактивность РНК-аз. Активность ферментов определяют по интенсивности поглощения при 260 ммк кислорастворимыхпродуктов разрушения РНК после ее инкубации с раствором фермента. Активные фракции (30 л) объединяют длядальнейшей очистки и нейтрализуют2 н. 1 аОН до рН 6,8-7,2.Фракции, содержащие фосфомонозстеразы (несвязавшиеся с ЦМ-А 2 волокном),объемом 70 л подвергают дальнейшейочистке.Выделение РНК-аз,Активные фракции (30 л) после хроматографии на 1 ь 1-А 2 волокне концентрируют ультрафильтрацией на пленкеУАМдо объема 0,5 л и диализуютпротив 0,01 н. трис-ацетатного буфера.рН 4,5 (на 1 л концентрата берется20 л диализующего раствора). Отдиализованный концентрат (0,7 л) наносятна колонку с КМ-целлюлозой (ОЙ 20 см)со скоростью 100 мл/ч, предварительно уравновешенную 0,01 н. трис-ацетатным буфером, рН 4,5, Элюцию ферментов с колонки ведут линейным градиентом концентрации 1 аС 1 от 0 до 1 М,объединенные активные фракции (Ч2,4 л) концентрируют ультрафильтрацией на мембране УАМдо объема30 мл и диализуют против О л 0,05 н,трис-НС 1, рН 7,5. Отциализованныйконцентрат (40 мл) наносят на колонкус гицрофильным гелем ЭД,5 (10150 см), уравновешенную 0,05 М трисНС 1 буфером, рН 7,5.140261Активные фракции, содержащие кислую РНК-азу (1,2 л), концентрируютультрафильтрацией до объема 50 мл,диализуют против дистиллированной; воды, лиофильно сушат, Удельная активность кислой РНК-азы 500 ед/мг,од 512.Активные фракции, содержащие щелочную РНК-азу (1,2 л), концентрируют 10до объема 10 мп, диализуют против0,01 н. ацетатного буфера, рН 3,5,при этом щелочная РНК-аза кристаллизуется, кристаллы отделяют центрифу" гированием и лиофильно сушат. Удельная активность щелочной РНК-азы800 ед/мг, выход 377.Выделение ФМЭ-аз.Фракции, несорбировавшиеся наЦМ-А 2 волокне, содержащие кислые фосФомоноэстеразы (70 л), концентрируютна ультрафильтрате с мембраной УАМ до объема 170 мл и наносят на колонкус сефадексом С(7,5150 см), пред- варительно уравновешенную 0,02 н. трисНС 1 буфером, рН 7,5. Хроматографиоведут тем же буфером со скоростью100 мл/ч. Активные фракции, содержащие Фосфомоноэстеразы (250 мл), диализуют против 5 л 0,02 н. трис-ацетатного буфера, рН 4,6 в течение 12 ч.Отдиализованньгй раствор (270 мл)наносят со скоростью 100 мл/ч на колонку с КМ-целлюлозой (5 100 см),предварительно уравновешенную 0,02 н.трис-ацетатным буфером; 4,6, колонкупромывают 1,4 л 0,02 М трис-ацетатного буфера, рН 4,6, со скоростью1,00 мл/ч, затем ведут элюцгпо раствором с линейным градиентом концентрации ИаС 1 (0-0,6 м) в том же буфере(2,5 л) и с той же скоростью, ФМЭ-аза1 выходит с колонки со свободным объемом, а ФМЭ-аза 11 выходит при градиентной элюции. Фракции, содержащие 45ФМЭ-азу 1 (560 мл) и ФМЗ-азу 11 )(320 мл), концентрируют ультрафильтрацией на мембране УАМдо 30 и20 мл соответственно.Концентрат ФМЗ-азы 1 лиофильно сушат и получают 300 мг белого порошкас удельной активностью 800 ед/мг белка. Выход ФМЭ-азы 1 составляет 457.от общего содержания фосфомоноэстеразв культуральной жидкости, 55Концентрат ФМЗ-азы 11 с удельнойактивностью 670 ед/мг белка замораживают и хранят при 20 С. Выход ФМЭ-азы 9 б11 составляет 107. от содержания фосФомоноэстераз в исходной культуральной жидкости,Таким образом, предлагаемый способпозволяет получать сразу четыре фермента из культуральной жидкости Репсд 111 цт Ъгеуд-сотрасЕггт после однойферментации, причем с сохранениемвысокого выхода и высокой удельнойактивности ФМЭ-аз по сравнению с указанными в известном способе,Формула изобретенияСпособ получения фосфоэстераз гриба Репдс 1111 ггш Ъгеч-согпрас 1 гггп ВКМ7=24640,предусматривающий культивирование гриба, анионообменную хроматографию культуральной жидкости последовательно на анионите ЭДЭ-ОП ианионообменном волокне ЦМ-А 2, десорбцию рибонуклеаз с волокна трис-ацетатным буферным раствором с возрастающей концентрацией ИаС 1, хромато-графию на гидрофильном геле с получением двух Фракций,- концентрированиеультрафильтрацией после каждой стадиихроматографии, диализ и лиофильнуюсушку фракции, содержащей кислую рибонуклеазу, ультрафильтрацию фракции,содержащей щелочную рибонуклеазу, ипоследующую ее кристаллизацию диализом, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что с целью более полного использования сырья за счет одновременноговыделения кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз 1 и 11,фильтрат культуральной жидкости санионообменного волокна ЦМ-А 2, содержащий кислые фосфомоноэстеразы, концентрируют ультрафильтрацией и подвергают хроматографии на сефадексеСс диализом активных фракций,при последующей хроматографии на КМцеллюлозе разделяют Фракции, содержащие фосфомоноэстеразу 1, которая выходит в свободном объеме колонки, ифракции, содержащие фосфомоноэстеразу 11, элюируемую линейным градиентомконцентрации хлористого натрия до0,6 М, последующее концентрированиеультрафильтрацией осуществляют раздельно для фосфомоноэстеразы 1 и фосфомоноэстеразы 11, затем раствор фосфомоноэстеразы 1 подвергают лиофильной сушке, а раствор Фосфомоноэстеразы 11 замораживают,