Штамм бактерий flаvовастеriuм ваlusтinuм продуцент рестриктазы fвl 1

сОК)з:. ОВетскихСОЦИАЛИСТИтЕСКИХРЕСПУБЛИК 9)5) 5 С 12 ч 9/1 зз ЭСЕСОЩЩщ 1 ЦЬИТВ т ИБЛИОтЯЦ 4,ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДЛРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологическихактивных веществ Научно-производственного объединения "Вектор"(56) йоЬегтз Й Йезтгсоп епугпез апс йег1 зосЫгогпегз. - М)с 1, Асоз Вез, 1988, К. 16,р. 271 - 313,(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Г АчОВАСТЕВОчВАЮЯТЙОМ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ГВ 1(57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы ГЫ 1, узнающей и расщепляющий последовательность нуклеотидов 6 Т (А/С) (6/Т) АС,Рестриктаза ГЫузнает и специфически гидролизует ДНК по последовательности ОТ(А/С) (ИТ) АС и является изошизомером рестриктазы Асс 1.Известен штамм ГачоЬасег 1 цт АТСС 33487, являющийся продуцентом рестриктазы ГЬэ 1, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов ТОАТСА, являющейся изошизомером Вс 1,Наиболее близким в предлагаемому штамму является штамм Ас 1 пеоЬас 1 ег- получение нового штамма, не требовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу ГЬ 1, способную узнавать и расщеплять последоватезль ность нуклеотидов ОТ(А/С) (6/Т) АС, Штамм ГачоЬастегит Ьацзпуггп ВКПМ В(324) получен как контаминант в результате поиска продуцентов растриктаз среди микроорганизмов, не требователен к питательным средам, растет на доступной дешевой среде отечественного производства, содержит тол ько одну рестри ктазу ГЬ 1по сра в- нению с тремя рестриктэзами известного штамма, Выход фермента ГЫсоставляет 2000 ед. акт/г влажной биомассы. Штамм продуцирует рестриктазу ГЫ 1, идентичнуо Асси заменяющую ее в генно-инженерных работах. О сасоасетс)3 - продуцент рестриктазы Асс. О узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов ОТ(А/С) (6/Т) АСНедостатком известного штамма явля- Ф ется то, что он продуцирует три рестриктазы С Асс 1, Асс 1, Асс 11, что усложняет процесс С выделения целевого фермента,Цель изобретения - лолуяение ноеого штамма, не требовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу ГЫ 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов ОТ(А/С) (О/Т) АС.Штамм ГачоЬассег 1)гп Ьа)зтпогп ВКПМ В - 4725 (324) получен как контаминант в результате поиска продуцентов рестриктаз сред микроорганизмов, взятых из различных мест обитания, 16894005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Гредлагаемый штамм Г.Вацзтпцгп 324характеризуется следующими признаками.Культурно-морфологические свойства,Клетки представляют тонкие со слегказакругленными концами грамотрицательные палочки размером 0,5 х 1, 5 х 1,8 мкм,трансформирующиеся в конце стационарной фазы роста в кокковидную форму, располагающиеся по одной или парами. Напитательном агаре через 16-18 ч инкубациипри 30 С образуют круглые с ровными краями, слегка выпуклые, полупрозрачные желтоватые колонии размером до 1 - 1,5 мм вдиаметре.Интенсивность пигментообразованиязависит от увеличения времени инкубациии снижения температуры, На триптозномагаре колонии сначала голубоватые, а черездвое суток становятся ярко-желтые, Консистенция колоний слизистая, Посев в жидкуюсреду приводит к ее равномерному помутнению, На среде Эндо розовые колонии появляются на 3-е сутки. На этаноламмонийнойсреде раста нет, На питательном агаре при5 С и в присутствии 6-ного хлористого натрия рост появляется на 2-е сфтки.Физиолого-биохимические свойства.Тест на оксидазу положительный, реакции на ацетоин и с метилсвым красным отрицательные. Проба на сероводородотрицательная, на индол положительная.На средах Гисса ферментирует без гаэообразования глюкозу, мальтоэу, маннозу. Неферментирует лактозу, ксилозу, арабинозу,рафинозу, маннит, дульцит, инозит. Окисляет 10 О/о-ную глюкозу и мальтозу, Желатингидролиэует на 5-е сутки. Нитраты, редуцирует, цитраты не ассимилирует, проба на,8-галактозидаэу отрицательная, на эскулини фосфатозу - положительные. Малонат неутилизирует. Лизин, аргинин, орнитин и фенилаланин не ферментирует,Отношение к антибиотикам.Культура устойчива к пенициллину, ампициллину,мономицину, неомицину, канамицину, оксациллину, чувствительна ктетрацикливу, стрептомицину, олеандомицину, левомицетину, эритромицину, карбенициллину, линкомицину, гентамицину,.рифампицину.Штамм хранят в лиофильно-высушенном состоянии и на питательном агаре подваэелиновым маслом,Для культивирования Е.Ьацзтпцпч 324применяют питательную среду следующегосостава, дистиллированная вода 1000,0; сухой дрожжевой экстракт 20,0; уксуснокислый натрий 2,0, сернокислый магний 0,2,фосфор н окисл ый калий 2,0. Готовая средаимеет рН 7 Культивирование проводят при 30 С со скоростью вращения качалки 200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста. Выход клеток З,О - 3,5 г/л культурал ь ной среды,Выход фермента ГЫ 1 составляет 2000 ед,акт/г влажной биомассы, Полученная рестриктаза ЕЫ 1 характеризуется следующими,свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5; оптимальная температура действия 37 С; сохраняет свою активность при выдерживании не менее 10 мин при 50 С; ингибируется при концентрации чаС 20 мМ,П р и м е р 1, Получение биомассы НачоЬас 1 егца Ьацзбпцщ 324.Клети Р 1;Вацзбпцт 324, хранящиеся под слоем вазелинового масла при 4 С, высевают на скошенном триптозный агар и инкубируют при 30 С 18-24 ч, Полученную культуру из расчета 10 О используют для засева 200 мл среды. Культивирование проводят на термостатированной качалке в течение 16 - 18 ч, Выход сырой биомассы составляет З,О г/л культуральной жидкости,П р и м е р 2. Выделение сайт-специфической эндонуклеаэы рестракции РЬ 1.5 г влажной биомассы суспендируют в 20 мл 0,02 М трис-НС - буфера (рН 7,5), содержащего 10 М Р - меркаптоэнтанола и 0,1 О тритон Х, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДНТ. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000 ц, ЗО мин) и надсадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5 М В 1 ойад) объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М калий фосфатным буфером, содержащим 10 М ф -меркаптоэтанола, 5 х 10 М ЭДТА 0,8 М йаС и 0,1 ф тритон х - 100 (буфер А). Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 200 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие максимальную активность, обьединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калий фосфатного буфера рН 7,5), содержащего 10 В -меркаптоэтанола и 5 х 10 М ЭДТА (буфер В), меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку обьемом ЗО мл с ДЕАДЕ-целлюлозой ДЕ, ИВаопап), уравновешенную буфером В, Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента ИаС 1 (0,0-1,0 М) в буфере В, Фракции, элюируемые.при 0,35-0,48 М йаС 1, содержат рестриктазу РЫ 1, Дальнейшую очистку Фермента проводят на фосфоцеллюлозе Р-И МВатглап). После диалиэа1 б 89400 против 2 л буфера В фермент наносят на колонку с Р- объемом 10 мл. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента МаС(0,0 - 1,0 М) в буфере В. Фракции, содержащие рестриктазу РЫ , элюируемые при 0,25 - 0,33 М йаС, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М йаС и 50 -ный глицерин,Ф о рмул а из о 6 рете н и я Составитель И.Чаплина Редактор И.Дербак . Техред М,Моргентал Корректор М.ДемчикЗаказ 3787 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Ферментный препарат хранят при С. Выход фермента 2000 ед. акт./г биомассы, активность 2000 ед./мл.За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 ЯС.Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой ЕЫ .Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой РЫ , проводят гидролиз ДНК фага А рестриктэзами РЫпо отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами, Электрофореграфически определяют продукты гидролиза ДНК. Наблюдаемая картинэ полного совпадения фрагментов, полученных при гидролиэе ДНК рестриктазамиЕЫи Асс порознь и совместно, указываетна то, что рестриктаза РЫявляется изоши 5 зомером рестриктазы Асс. узнает и расщепляет последовательности нуклеотидов6 Т(А/С)(6/Т)АСШтамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным:10 штамм содержит только одну рестриктазуЕЫпо сравнению с тремя рестриктазами,продуцируемыми известным штаммом, атакже растет на доступной дешевой средеотечественного производства,15 Поскольку рестриктаза ГЫузнает ирасщепляет последовательность нуклеотидов ОТ(А/С)(6/Т)АС, она может заменитьрестриктазу Ассво всех генно-инженерных работах.20 Штамм бактерий ЕачоЬастегов Ьацзтпцв - продуцент рестриктазы ЕЫ .25