Способ получения рестриктазы sfa ni, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -gcatcn, 3 -cgtagn
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК А 09) 8И 1 Л.: И ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБР й АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный научно-исследователский институт молекулярной биологии(56) апц 1 а 1 Ыв А., Иагс 1 пЕеч 1 с 1 е" пе , Реггцяуге И., Идгопоч А. А. пеы Беццепсе-яресдйдс епйопцс 1 еазе Егош Бггергососсця йцгапя. - РЕВЯ Ьеггегв, 1981, 134, 172-174.Р 1 гг 8 ег 1 ай С.Р., Па 1 у С., Игом Ь.К., Сдпаегав.Т.К. Бо-.Р 1; А пеы веццепсе-яресЫ 1 с епйопцс 1 еаве Йгош Яггергососсцв сгешог 1 в. - Мцс 1 е 1 с Асдйя Кев, 1982, 10, 24, 8171- 8179К 5 К " К 1 п 8 С.Т., ау Е. А пед яесцепсе-вресЫ 1 с епйопцс 1 еаяе ггош , Бггергососсця Йаеса 11 в вцЬяр, гушояепез. - Сепе, 1978, 4, 4, 329-336. 5 4 С 12 М 9/14, 15/00// //(С 12 М 9/14, С 1.2 К 1(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫБРА М 1, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ5 -ССАТСМ, 3 -ССТАСМ 1(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения ферментов нуклеинового обмена. Цель изобретения - повышениеудельного выхода и удельной активности рестриктазы Ыа М 1. Штамм Бггергососсця Гаеса 11 я В, продуцентрестриктазы Бйа М 1, выращивают на питательной среде следующего .состава,г/л: триптон 10, глюкоза 5, дрожжевойэкстракт 5, КНРО 4 68 до достиженияоптической плотности 2,4-2,8 о.е,при=600 нм, Биомассу осаждают цент- уурифугированием и разрушают на ульт- М Фразвуковом дезинтеграторе, клеточныеобломки осаждают повторным центрифу-гированием. Очищают хроматографиейна фосфоцеллюлозе Р, а затем наИзобретение относится к микробиологии и касается способов получения ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз. 5Целью изобретения является повышение удельной активновти и выхода целевого продукта.Для осуществления способа подбирают концентрацию неорганического Фосфа 10 та. Экспериментальные данные представ. лены в табл. 1.Как виднб из табл. 1, оптимальная концентрация КНР 01 составляет 68 г/л и значительно (в 34 раза) превышает 15 концентрацию КНРО в известном способе.Оптимальную Фазу роста, при которой следует прекратить культивирование и начинать сбор урожая, подбира ют, исходя из экспериментальных данных, приведенных в табл. 2,Наибольший удельный выход рестриктазы наблюдается при оптической плотности 2,4-2,8 о.е, 25Биомассу осаждают центрифугированием и подвергают разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе МБЕ. Клеточные обломки осаждают повторным центрифугированием. Хроматографичес кую очистку проводят, используя Фосфоцеллюлозу Р, дальнейшую очистку ведут на ВЕАЕ-целлюлозе. Концентри" рование осуществляют хроматографией на Рцеллюлозе.35П р и м е р 1 (по известному способу), Получение рестриктазы МаИ 1 из ЬТгерососсцз Йаеса 1 хз ИВ 547.Клетки высевают на чашки с питательной средой следующего состава г/л: триптон (ВЫсо) 10; дрожжевой экстракт (ВЫсо) 5; глюкоза 5; КНРО 2 (рН 7,2); агар 15, инкубируют при 37 С. Выросшие клетки вноосят бактериологической петлей в 100 мл жидкой питательной среды такого же состава (без агара) и культивиоруют при 37 С. Затем инокулят вносят в 2 л свежей питательной среды и куль. тивируют до оптической плотности 1,5 о,е, при длине волны =600 нм. Биомассу осаждают центрифугированиемна центрифуге,3 - 21, ротор 3 А -10,8 тыс. об/мин 15 мин. Выход биомассы 6,6 г.Биомассу суспендируют в 48 мл 10 мМ трис-НС 1 (рН 7,5), содержащего10. мМ 2-меркаптоэтанола, и разрушают в ультразвуковом дезинтеграторе МЯЕ три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкмКлеточные остатки осаждают при 16 тыс. об/мин в течение 30 мин. Осветленный супернатант наносят на колонку с ВО Се 1 А 0,5 М. Фракции, содержащие эндонуклеазные активности, собирают и концентрируют диализом против 1007 глицерина и далее диализируют против буфера 1, содержащего 10 мМ К-Р (рН 7,4), 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА и 10 Е глицерина. Пробы наносят на колонку с ВЕАЕ-целлюлозой. Элюцию ведут в линейном градиенте 0-0,5 М КС 1 в буфере 1. Эндонуклеазу диализуют и очищают в колонке с Фосфоцеллюлозой (0,5 х х 15 см). Элюцию ведут линейным градиентом 0-1,0 М КС 1 (140 мл) в буфере 1. Эндонуклеазные пробы собирают и используют в экспериментах. Выход рестриктазы 150 е.а,/г биомассы, Активность фермента 600 е,а./мл.П р и м е р 2 (по предлагаемому способу). Получение Нйа И 1.Культивирование ведут как в примере 1, только в составе питательной среды вместо дрожжевого экстракта фирвмы ВЫсо используют дрожжевой экстракт НПО "Биолар", а концентрация КНРО составляет 68 г/л. Культивирование ведут до оптической плотности 2,4. Выход биомассы 11,2 г.Выделение и очистка Бйа М 1. Выделение фермента проводят при 4 С, Биомассу ресуспендируют в буфере А (0,05 М трис-НС 1, рН 75; 5,4 10 М ЭДТА, О, 1 М 2-меркаптоэтанол, 0,2 Х ИР) в соотношении 6 г биомассы на 20 мл буфера. Разрушают ультразвуком в ультразвуковом дезинтеграторе МБЕ три раза по 40 с на частоте 20 кГц, амплитуда 12 мкм, Осаждают клеточные остатки при 16 тыс, об/мин в течение 30 мин, Осветленный супернатант наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р, предварительно уравновешенную буфером В (0,02 М КНРО, рН 7,5; 5,4 10 М ЭДТА, 0,1 М 2-меркаптоэтанол), колонку промывают этим же буфером, объем которого равняется двум объемам смолы. Сорбированный на Фосфоцеллюлозе белок смывают 1 М ИаС 1 в буфере, собранный белок диализуют 3 ч против 3 л буфера и.наносят на колонку с ВЕАЕ-целлюлозой. Элюцию проводят 40 мл буфера В с линейным градиентом ИаС 1 (О " 1 М), собирают фракции по 2 мл.фермент элюируют при 0,4-0,6 М ХаС 1. Фракции, содержащие Ферментативную активность, собирают, диализуют 3 ч против 3 л буфера В и концентрируют5 с помощью хроматографии на Рцеллюлозе объемом 3-5 см. Элюцию проводят градиентом Г 1 аС 1 в буфере В, 40 мл 0 - 1 М. Фермент смывают с колонки при 0,65 М Г 1 аС 1. Фракции по 2 мл, 10 содержащие Бйа М 1, собирают, диализуют 20 ч против буфера С (0,02 М К-фосфат, рН 7,5; 0,02 М КС 1, 5,4х 10 М ЭДТА, О, 1 М 2-меркаптоэтанол, 503 глицерин). 15Определение активности фермента проводят следующим образом.К 30 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг ДНК фагаС 1857 (0,02 М трис-НС 1, рН 7,5; 0,01 М М 8 С 1, 20 О, 15 М Г 1 аС 1), добавляют 1 мкл из соответствующих Фракций при очистке фермента. Инкубацию ведут 60 мин прио37 С. Продукты гидролиза анализируют электрофорезом в 1,7 Х-ной агарозе в 25 трис-ацетатном буфере, рН 0,05 (0,5 М трис-НС 1, 0,2 Г 1 ацетат натрия, 0,02 М ЭДТА). Гель окрашивают бромистым этидием (5 мг/л), фотографируют в ультрафиолете через красный светофильтр З 0(К). За единицу активности прини." мают количество Фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК фагаС 1857 за 1 ч при 37 С.Выход рестриктазы на 1 г биомассы составляет 600 е.а. Активность Фермента 4000 е.а./мл.Результаты сравнения известного и предлагаемого способов представлены в табл. 3. 40П р и м е р 3. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут до оптической плотности 2,8 при длине волны % =600 нм. Выход биомассы 13 г. Выход фермента 610 е.а./1 г био массы, а его активность 4000 е.а./мл (табл.3).П р и м е р 4. Фермент получают по примеру 2, но культивирование ведут до, оптической плотности 1,0 при длине волны =600 нм, Выход рестриктазы 100 е.а./г биомассы.П р и м е р 5. Фермент получаютпо примеру 2, но концентрация КНР 04 в культуральной жидкости 27 Г/ле Вы ход биомассы 12,8 г, выход рестриктазы 200 е,а./г. П р и м е р 6. Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-фазы, выход фермента 580 е.а./г.П р и м е р 7Фермент получают по примеру 3, но концентрация глюкозы 1 г/л. Отмечается увеличение темпов роста, но выход фермента снижается до 500 е.а./г.П р и м е р 8. Фермент получают по примеру 3, но концентрация дрожжевого экстракта 10 г/л. Резко ингибирует рост культуры, фермент не удается тестировать.П р и м е р 9. Фермент получают попримеру 3, но концентрация дрожжевогоэкстракта 3 г/л. Отмечается увеличение лаг-периода, выход фермента300 е.а./г.Концентрацию триптона подбирают,исходя из экспериментальных данных,представленных в табл. 4,Предлагаемый способ позволяет увеличить выход биомассы с 1 л культуРальной жидкости в 1,5-2,0 раза,увеличить выход фермента на 1 г биомассы в 4 раза и повысить его активность в 6-7 раз (табл.3).ф о р м у л а изобретенияЧСпособ получения рестриктазы Бала И 1, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССАТСГ 1, 3 -ССТАСИФ, включающий культивирование продуцента штамма БТгерососсця Гаеса 11 я при 37 С в питательной среде, содержащей триптон в концентрации 10 г/л, глюкозу и дрожжевой экстракт в концентрации по 5 г/л, двуэамещенный фосфат калия и воду, центрифугирование биомассы, разрушение клеток ультразвуком и хроматографическую очистку, включая, ДЭАЭ-целлюлозу и Фосфоцеллюлозу, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной активности и выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм ЯСгерйососсця Еаеса 1 дя ВКПМ В, культивирование ведут на среде, содержащей двузамещенный фосфат калия в концентрации 68 г/л, до достижения оптической плотности 2,4-2,8 о.е, при А=600 мм.,е,а. 2 150 Сильное закисление среды приОПдо 1 о. е. 200 27 300 Активный рост 610 68 81 Культура не растет Та блица 2 Оптическая плот- Выход Фермента,ность=600 нм, е,а./го.е. 0,62 100 100 1,00 2,4 600 2,8 610 3,2 100 4,0 100 Концентрация,г/л Выход Фермента на1 г биоКультуральная ха"рактеристика Активный рост доОПоу 5 о. е. Наблюдается угнетение роста, стационарная Фазапри ОП =4 о.е.Параметры извест- предланому гаемому Выход фермента,е.а./л 4000 500 150 610 Активность фермента, е.а./мл 600 4000 Таблица 4 Концентра- Выход фер- Дополнительная ция трип- мента на характеристика тона, г/л 1 г,е.а. 500 Увеличение лагфазы роста Стабильное 600 культивирование 15 600 Составитель Н.ХодаровРедактор Н,Гунько Техред М.Дидык Корректор М.Демчик Заказ 6355/23 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5
СмотретьЗаявка
4265156, 20.04.1987
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
ЖИЛКИНА ОЛЬГА АНАТОЛЬЕВНА, РЕПИН ВЛАДИМИР ЕВГЕНЬЕВИЧ, ДЕГТЯРЕВ СЕРГЕЙ ХАРИТОНОВИЧ
МПК / Метки
МПК: C12N 15/00, C12N 9/14
Метки: cgtagn, gcatcn, нуклеотидов, последовательность, расщеплять, рестриктазы, способной, узнавать
Опубликовано: 07.12.1988
Код ссылки
<a href="https://patents.su/5-1442546-sposob-polucheniya-restriktazy-sfa-ni-sposobnojj-uznavat-i-rasshheplyat-posledovatelnost-nukleotidov-5-gcatcn-3-cgtagn.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения рестриктазы sfa ni, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -gcatcn, 3 -cgtagn</a>