Способ определения 17-кетостероидов в моче

,ЯО 132 58 С 01 И 33/74 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ-КЕТОСТЕР ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Семипалатинский государственныймедицинский институт(56) Комиссаренко В. П., Демченко В, Н, Количественное определение8 важнейших фракций 17-кетостероидовс помощью двумерной тонкослойной хроматографии в моче человека. - Лабораторное дело, 1974, В 2, с. 73-76.(57) Изобретение относится к биологиии медицине, точнее к способам исследования андрогенов, предназначенодля выявления вариантов превращения17-кетостероидов (17-КС) в организме, а также для диагностики эндокрин-,ной патологии. Цель изобретенияповышение чувствительности способа,Для этого пробы из суточндго количества мочи с рН 6,5 охлаждают, добавляют ацетатный буфер (рН 4,5) и навеску Р-глюкуронидазы 30000 ед. активности, выдерживают .в термостатепри 37 С, через сутки добавляют туже дозу фермента и.держат еще сутки.После гидролиза приливают 403-ный раствор формальдегида, кипятят 2 мин,охлаждают, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центри-фугированием, Надосадок сливают,экстрагируют двумя объемами смесихлороформ - диэтиловый эфир (1:1)Образовавшуюся эмульсию расслаивают,как и весь экстракт, и объединяют сорганической и водной фазами. Экстракт промывают насыщенным растворомбикарбоната натрия и дистиллированнойоводой, сушат и выпаривают при 40 С.После отгонкн диэтилового эфира выпаривают хлороформ, освобождают отбольшинства липидов. В пробе мочихроматографированием выделяют глюкурониды и сульфаты 17-кетостероидов,окрашивают их 2,4-динитрофенилгидразином, раздельно хроматографируют.Затем фотоэлектроколориметрируют вмикрокюветах с короткофокусными линзами. Расчет фракций проводят по концентрационной кривой, построеннойпосле хроматографирования различныхколичеств дегидроэпиандростерона сучетом суточного диуреэа. Способ позволяет раздельно анализировать 17-КС,находящиеся в соединении с глюкуроновой и серной кислотами. В результате исследуют До 24 индивидуальных17-КС, что имеет важное значение воценке андрогенной функции коры надпочечников и половых желез, 1328758 210 Изобретение относится к биологиии медицине, а именно к способам исследования андрогенов, и может бытьиспользовано для выявления различныхвариантов превращения 17-кетостероидов (17-КС) в организме, обусловленных физиологическими и патологическими факторами, а также для целей диагностики эндокринной патологии.Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет раздельного исследования глюкуронидов исульфатов 17-кетостероидов, окрашивания их 2,4-динитрофенилгидразином,раздельного .хроматографирования споследующим фотоэлектроколориметрированием в микрокюветах с короткофокусными линзами.Способ осуществляется следующимобразом.Из суточного количества отмеряютнебольшую эрленмейеровскую колбочу 30 мл профильтрованной мочи, устанавливают рН б,5, добавляя каплями.2 н. раствор едкого натрия или соляной кислоты, и кипятят 3 мин для разрушения ингибитора фермента-глюкуронидазы. Пробу охлаждают, добавляют 20 мл ацетатного буфера (рН 4,5)и навеску-глюкуронидазы, соответствующую 30 000 ед. активности, за"тем выдерживают в термостате прио37 С в течение двух суток с повторнымдобавлением через 24 ч той же дозыфермента,После гидролиза приливают 0,3 мл 40 -ного раствора Формальдегида, кипятят 2 мин, охлаждают под водопроводной водой, отделяют выпавший в осадок денатурированный фермент центрифугированием при 10 000 об. в те. - чение 5 мин, Надосадочную жидкость сливают в делительную воронку, экстрагируют 5 мин двойным объемом смеси хлороформ - диэтиловый эфир (111). После расслаивания экстракт сливают в чистую делительную воронку. При наличии эмульсии, которая располагается в верхней части экстракта, ее расслаивают центрифугированием и объединяют соответственно с органической и водной фазами,Экстракт промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и дистиллированной водой дважды по 1/5 объема, сушат над безводным сернокислымнатрием и выпаривают в круглодонной 15 го 25 30 35 40 45 50 55 колбе емкостью 50 мл при 40 С, После отгонки диэтилового эфира снстему соединяют с водоструйным насосом длявыпаривания хлороформа. Сухой остаток смывают со стенок на дно колбы5 мл метанола, закрывают пробкой ипомещают в морозильную камеру холодильника. Через 14-1 б ч метанол осторожно сливают в пробирку и выпаривают в токе азота. Таким путем удается освободиться от большинства липидов,Для более полного освобождения от липидов и пигментов экстракт, сконцентрированный на дне пробирки, растворяют, добавляя по 3-4 капли хлороФорм - метанола, и наносят в виде полоски шириной 2-3 мм и длиной 80 ммна пластинку силуфола так, чтобы расстояние от боковых краев соответствовало 35 мм, а от нижнего - 20 мм.Смывание экстракта повторяют до полного обесцвечивания растворителей.На 1,5 см от экстракта с двух стороннаносят по 5-10 мкг андростандиона идважды хроматографируют в системехлороформ - этанол (49,5;0,5),Места расположения пятен свидетелей проявляют, опрыскивая смесью 2 7. -ного раствора - динитробензола в этаноле и 207.-ного раствора КОН в метаноле (1:1) при экранировании остальных участков хроматограммы, Сорбентот зоны расположения свидетелей иниже, включая стартовую линию соскабливают с фольги, переносят в пробирку и дважды экстрагируют по 30 мин5 мл дихлорэтан - метанола (9:1),центрифугируют сливают в пробирку ивыпаривают в токе азота.Для сальволиза сульфатов к мочепосле извлечения глюкуронидов приливают небольшими порциями 307.-ный раствор серной кислоты, устанавливаярН 1 и добавляя мелко измельченныйсульфат аммония до насыщения. Проводится повторная коррекция рН ЗОБ-нымраствором серной кислоты и смесь дважды экстрагируют по 20 мин равнымобъемом этилацетата. Объединенныезтилацетатные экстракты выдер;т ахаюто/в термостате при 37 С в течение ч 8 ч.После сальволиза дальнейшую обработку упомянутого экстракта осуществляют аналогично хлороформно-эфирному,Для перевода глюкуронидов и сульфатов 17-КС в окрашенные комплексы копытным пробам в вытяжном шкафу приливают растворы 2,4-динитрофенилгид28758 з13 разина (0,037,; 0,5 мл) и трихлоруксусной кислоты (О,ЗЖ; О,1 мл), выдерживают их в темноте, сначала прио температуре водяной бани 80 С 10 мин,оа затем при 60 С в течение 30 мин, Экстракты выпаривают в токе азота.В отдельные пробирки отмеряют спиртовые растворы эталонов стероидов и переводят их в 2,4-динитрофенилгидразоны вышеописанным способом, Опытные пробы после предварительного растворения в 0,2-0,3 мл бензола переносят тонкими иглами (диаметр 0,3- 0,5 мм) из нержавеющей стали с отшлифованными концами на отдельные пластины силуфола (15 х 15 см) в одну точку слева на расстоянии 2,5 см от нижнего и бокового краев. В правый нижний угол на таком же расстоянии наносят эталоны 17-КС, Повторные смывания и перенесение окрашенных проб стероидов на слой сорбента повторяют до обесцвечивания растворителя,Разделение 17-КС осуществляют в двух стеклянных камерах с притертыми крышками для пластинок силуфола, в которые за 30 мин до хроматографирования наливают по 50 мл смеси растворителей: в первую хлороформ - ацетон (47:3), а во вторую - диэтиловый эфир - петролейный эфир (35;15), В каждой системе (вначале в первой, затем во второй) хроматографируют дважды, не доводя Фронт растворителей до верхнего края пластинки на 2,5 см.После каждой разгонки выдерживают в вытяжном шкафу 20 мин, Хроматографирование во второй системе проводят в направлении, перпендикулярном первоначальному, перед этим ниже опытной пробы на 0,5 см наносят в одну точку эталоны 17-КС, После разделения в 1-й и 2-й системе растворителей 17-КС с восстановленным кольцом А видны на хроматограмме в виде желтых,4а с наличием й -3-кетогруппы - оранжевых пятен. Идентификацию стероидов проводят при помощи стандартов.Полученные Фракции стероидов и равные по площади участки сорбента соскабливают с алюминиевой фольги глазным копьем, переносят в пробирки, приливают по 1,0 мл этанола, встряхивают 60 мин, центрифугируют, сливают в другой ряд чистых пробирок и выпаривают досуха, Затем добавляют по 0,5 мл этанола, встряхи 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вают и замеряют оптическую плотностьхромогенов на ФЭК 56-М при длиневолны 360 нм (фильтр Р 2) в микрокюветах (рабочая длина 4,99 мм) скороткофокусными линзами.Расчет фракций проводят по концентрированной кривой, построеннойпосле хроматографирования различныхколичеств дегидроэпиандростерона сучетом суточного диуреза.П р и м е р 1, Мужчина Ж.,29 лет, здоров. Суточная экскреция17-КС составила 7,54 мг (глюкурониды 2,62 мг, сульфаты 4,92 мг). В глюкуронидах выделено двенадцать, всульфатах - семь фракций, Наибольшая,концентрация андростерона и 11-15-оксиандростендиона выявлена в глюкуронидах, а андростерона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона и эпиандростерона - в сульфатах.П р и м е р 2, Мужчина М38 лет, здоров, С суточной. мочой выделено 8,59 мг 17-КС (глюкурониды5,59 мг, сульфаты 3,0 мг). В глюкуронидах выявлено двеннадцать, в сульфа-,тах - девять Фракций. Концентрацияандростендиона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона, 11-8-оксиандростендиона, 11-15-оксиандростерона и11оксиэтиохоланолона была выше вглюкуронидах, а андростендиона иандростерона - в сульфатах. В сульфатах не определялись 11окси- и11-кетоандростерон,Л р и м е р 3, Больной Т.,27 лет, с синдромом Штейн-Левинталя.С суточной мочой выделено 7,28 мг17-КС (глюкуронидов 3,7 мг, сульфатов 3,58 мг; одиннадцать и семь Фракций соответственно), Обнаружено повышенное выделение глюкуронидов исульфатов андростерона, этиохоланолона, дегидроэпиандростерона.и его производного - андростендиона, что можно объяснить замедлением превращенияпоследнего в экстрогены. В то же время наблюдается увеличение суточнойэкскреции 11-кетоандростендион-сульфата. Это обстоятельство, очевидно,обусловлено отклонением направленности метаболизма андростендион-сульфата, Вместо эстрогенов андростенди".он-сульфат в повышенных количествахпревращается в 11-кетоандростендионсульфат, Отмечается также повышениеглюкуронидов 11-ф-оксиандростерона и11-р-оксиэтиохоланолона, что может1328758 свидетельствовать об ускорении окислительного пути метаболизма кортиэола. Формула изобретения Составитель И. ЕмельяненкоТехред М.Ходанич Корректор С, Шекмар Редактор П. ГерешиЗаказ 3480/48 Тираж 776Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытийПроизводственно 1 толиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Предлагаемый способ выгодно отличается от других тем, что позволяет раздельно анализировать 7-КС, находящиеся в соединении с глюкуроновой и серной, кислотами. В результате разделения глюкуронидов и сульфатов на 0 12 фракций представляется возможность исследования до 24 индивидуальных 17-КС. Применение микрокювет с короткофокусными линзами позволяет определять в опытной пробе с достаточно 5 высокой точностью небольшие количества 10,5-1,0 мкг) анализируемых гормонов, Выявление более широкого спект-: ра индивидуальных 17-КС имеет важное значейие в оценке андрогенной фуйк ции коры надпочечников и половых желез, в изучении особенностей метаболизма означенных стероидов при различных физиологических н патологических состояниях организма. Способ определения 17-кетостерондов в моче путем хроматографии с последующим фотоэлектроколориметрированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повь 1 шения чувствительности способа, иэ мочи больного выделяют глюкурониды и сульфаты 17-кетостероидов, окрашивают их 2,4-динитрефенилгидразином, раздельно хроматографируют, а фотоэлектроколориметриюпроводят в микрокюветах с короткофокусными линзами,