Способ определения специфической флуоресценции лимфоидных клеток крови

,80132875 Й 3 ОПИСАН РЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТВУ нн сад, 5 с 1. ваннои ан измерение и светорас способа по НИЯ СПЕЦИИДНЫХ КЛЕТ(54) СПОСОБ ОПРФЛ 1 ООРЕСЦЕНЦИИ ИЧЕ СКОЙ КРОВИ ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Киргизский государствецинский институт(57) Изоблогии, Целточностиления, Либируют иют. Клетния на ст тение относится к иммуноизобретения - повышение ускорение способа опредефоидные клетки крови инкусле отмывания суспензируную взвесь после нанесело инкубируют. Мазок подкрашивают флюорохромироисывороткой и проводят клеточной флюоресценции еяния. Чувствительность ышается в 1,4 раза,57 1 13287Изобретение относится к медицине,в частности к иммунологии.Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа определенияСпособ осуществляется следующим образом.Лимфоидные клетки крови из разных источников (свежевыделенные клетки крови, клетки из культур ткани) инку бируют 30 мин при комнатной температуре в 2,5%-номрастворе ЭДТР, в котором содержится метиорлат 1",10000, и затем трижды отмывают этим же раствором, После последнего отмывания клет ки суспензируют в одной капле раствора ЭДТА и каплю клеточной взвеси наносят на чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло.Предметное стекло с нанесенной 20 каплей клеточной взвеси инкубируют 3 мин во влажной камере, затем стекло несколько раз проводят над пла енем горелки и погружают ребром в сосуд с водопроводной водой для уда ления неприкрепившихся к стеклу клеток. Полученный мазок несколько раз промывают водопроводной водой, подсушивают на воздухе и окрашивают флюорохромированной антисывороткой 30 против излучаемых иммуноглобулинов Рабочее разведение антисыворотки и время скрашивания подбирают в предварительных опытах.После скрашивания препараты промывают в водопроводной воде, высушивают, после чего они готовы для исследования, Изучение окрашенных клеточных препаратов проводят в цито-, флюориметре типаЛюмам-ИПеред . 40 исследованием из цитофпюориметра убирается один из микрозондов для того, чтобы обеспечить измерения не с участка, ограниченного размерами микрозонда, а со всего участка кле б точного препарата, находящегося в .поле объектива.При измерении зеленой флюоресценции с максимумом излучения 530 нм устанавливают следующую систему возбуждающего освещения: светоделительная пластинка темного поля, возбуждающие фильтры СЭС 24-4, ФС 1-4; эпиобъектив 21 А 0,40; вместо запирающего фильтра в цитофлюориметре устанавливается интерференционный светофильтр с максимумом пропускания, соответствующим максимуму флюоресценции 530 нм (фильтр В 8 в ЦФМ "Люмам-И"). При измерении светорассеяния смаксимумом излучения 410 нм (возбуждающий светофильтр ФС-4) используется интерференциональный фильтр ссоответствующим максимумом пропускания 410 нм (фильтр Р 3 в ЦФМ "ЛюмамИ"). Кроме того, в возбуждающуюсистему дополнительно вводится дляослабления интенсивности световогопотока матовый светофильтр (МС 13-2).Измерения проводят в следующемпорядке.Убирают один из микрозондов флюориметра, Устанавливают возбуждающееосвещение сверху и регулируют его итемнопольный вариант, Устанавливаютповоротом диска интерференционныйсветофильтр И" 8, Устанавливают напредметный столик стекло с окрашенными клетками и наводят резкость (этаоперация выполняется с одним из оставшихся микрозондов цитофлюориметра),Поворотом диска устанавливают положение, соответствующее убранномумикрозонду, Открывают диафрагму фотоэлемента, снимают показания ре"гистрирующего прибора, Измерение суммарной флюоресценции закончено.В систему возбуждающего освещениявводят матовый светофильтр. Поворотом диска устанавливают интерференционный фильтр У 3, Открывают диафрагму фотоэлемента, снимают показания регистрирующего прибора. Измерение суммарного светорассеяния закончено.Величину суммарной флюоресценции/Г/ делят на величину светорассеяния //. Полученная величина /С/соответствует средней внутриклеточной концентрации изучаемого нммуноглобулина,В системе возбуждающих фильтровдобавляют матовый светофильтр МС 13-2,Устанавливают интерференционныйсветофильтр Р 3, открывают диафрагму фотоэлемента, На регистрирующемприборе показания 0,579 В,Суммарную величину флюоресцзнции0,221 В делят на суммарную вепичину светорассеяния 0,579 В. Средняявнутриклеточная концентрация иммуноглобулинов составляет 0,382,П р и м е р Больная Г. Диагноз:бронхнальная астма, Лимфоидные клетки крови выделяют путем центрифуги13 Составитель В,ФроловаРедактор П.Гереши Техред М,Ходанич Корректор А.Зимокосов Заказ 3480/48 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4 рования в градиенте плотности фиколверографин, инкубируют 30 мин прикомнатной температуре в 2,57.-номрастворе ЭДТР, содержащем метиорлат1:10000, и трижды отмывают в этомже растворе. Клеточный осадок ресуспензируют в одной капле промывающего раствора и каплю взвеси наносятна предметное стекло. Стекло инкубируют 3 мин во влажной камере,прикомнатной температуре, после чегостекло несколько раз проводят надпламенем горелки и погружают несколько раз ребром в сосуд с водопроводной водой. На месте капли остаетсячетко заметное клеточное пятно,После просушивания на клетки наносят одну каплю антиглобулиновойлюминисцирующей сыворотки в разведении 1:3 (рабочий титр на этикетке1:16), инкубируют 30 мин во влажнойкамере при комнатной температуре,погружают на 1 О мин в водопроводнуюводу, подсушивают и проводят измерения клеточных флюоресценции и светорассеяния,Из цитофлюориметра убирают микрозонд 0,1 мкм. Возбуждающее освещение сверху устанавливают по методутемного поля, Фильтры СЗС - 24-4;ФС-4, Интерференционный фильтр У 8эпиобъектив темного поля 21 к 0,40,ток лампы 4 А.Устанавливают один из сохранившихся микрозондов 0,5 мкм) и наводят 28757 4резкость на изображении участка окрашенного препарата. После этого устанавливают положение, соответствующее убранному зонду (0,1 мкм), и открывают диафрагму фотоэлемента. На регистрирующем приборе показания 0,221 В,Поставленная: цель достигается тем, что известным способом увеличение внутрикисточной концентрации иммуноглобулинов определяют в 707. случаев, с помощью предлагаемого способа - в 1003, т.е. чувствительность предлагаемого способа в 1,4 раза вьппе, при этом время на выполнение измерений в 20 раз меньше,Ф о р м у л а изобретения 20Способ определения специфическойфлюоресценции лимфоидных клеток кро-ви, включающий окрашивание клетокспецифическими антителами, связанны ми с флюорохромом и имерение флюоресценцин под микроскопом .с помощью флюориметра, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, измерение 30 фпюоресценции осуществляют при маломувеличении, дополнительно устанавливают величину светорассеяния и определяют специфическую флюоресценцию лимфоидных клеток по отношениювеличины Флюоресценции к светорассеянию,