Способ определения энтеротоксина сальмонелл

(50 4 С 01 И 33/5 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ в жидкой питател ьной средением бактер гироваиием ния их с посл альных и иссл чающ щим лизиров клеток, центриф ованием суперна й ся тем, что,аята, отл целью уско упрощения ормалинизи сарЬУосос ют их с и ой к терм кишечной п конъюгат способа, дополнируют стафилококки сцз аигеиз Сочап 1, ммунной кроличьей олабильному энтеро- алочки, далее по- добавляют к испыения ельн штаммаинкубирсывороттоксину енный ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(71) Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН ССС(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНА САЛЬМОНЕЛЛ путем выращиватуемому супернатанту и по интенсивности агглютинации определяют энтеротоксин сальмонелл.еИзобретение относится к медицине,а именно инфекционной патологии,и может быть использовано с эпидемиологическими целями для выявлениятоксикоинфекций, вызванных сальмонеллами.Цель изобретения - упрощение иускорение способа определения сальмонеллезного энтеротоксина с сохранением высокой специфичности и чувствительности анализа.Выросшую микробную культуру сальмонелл подвергают лизированию любым известным способом, центрифугируют и исследуют супернатант в реакции коагглютинации на часовом стекле с использованием стафилококковых клеток штаммаСоюап 1, содержащих белок А, соединенный с антителами, к термолабильному энтеротоксину кишечной палочки. Данная реакция возможна вследствие иммунологического родства энтеротоксинов кишечной палочки и сальмонелл,Способ осуществляют следующимобразом.Выполненные при профилактическихосмотрах или от больных людей, а так"же депонированные музейные культурысальмонелл выращивают в 10 мл любойжидкой питательной среды в пробиркахобъемом 40-50 мл в течение 24-30 чпри непрерывном встряхивании шуттельаппаратом при 210 об/мин и при 37 С.Далее проводят центрифугирование при8000 об/мин в течение 15-20 мин,недостаточную жидкость отбрасывают,к осадку микробных клеток добавляют0,5 мл дистиллированной воды и лиэируют любым известным способом. Затем полученные лизаты центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1520 мин, осадок отбрасывают, а супернатант используют для,цальнейшегоисследования в реакций коагглютинации.Для проведения этой реакции готовят стафилококковый диагностикум последующей методике.Культуру ЯСарЬ 1 ососсцв ацгецвСочап 1 выращивают на мясо-пептонном агаре Хоттингера (с содержаниемаминного азота 180 мг %) в матрицахи смывают небольшим количествомПолученную микробную взвесь отмывают в буфере трижды. Отмытые клеткисуспендируют в фосфатно-солевом буФере и готовят взвесь микробов, содержащую 50-100 млрд. микробных клеток в 1 мп по оптическому стандарту мутности, К взвеси клеток добавляют коммерческий формалин до конечной концентрации в растворе 0,5%, Формалинизирование проводят в тече 10 ние 1 ч при 37 С на шуттель-аппарате (100 об/мин). Клетки отмывают отФормалина трижды Фосфатно-солевым буфером, а затем в том же буфере готовят 10%-ную взвесь клеток (по объему). Взвесь стабильна в течение 30 дн при 4 С.Для сенсибилизации клеток БСарЬ 1." 1 ососсцв ацгецв Сочап Т с целью получения сальмонеллезного диагности 15 20 кума в качестве источника специфических иммуноглобулинов используют антиэнтеротоксическую сыворотку ктермолабильному энтеротоксину кишечной палочки с преципитирующим титром 1:16 и выше, не содержащую антитела к другим антигенам кишечной палочки,Сыворотку в количестве 0,1-0,2 мя добавляют к 1 мл 10%-ной взвеси фор 30 50 35 40 45 малинизированных клеток Я. ацгецвСоюап Т, перемешивают в течение 2"3 мин при комнатной температуре,затем однократно отмывают суспензиюот избытка антител при центрифугировании 1000 об/мин в течение 1520 мин. Осадок суспендируют в 10 млфосфатно-солевого буфера, Реагентомв работе является взвесь стафилококков с адсорбированной на них антисывороткой, Срок хранения реагентаопри 4 С не более 1-2 недель,В качестве контроля на годностьиспользования реагента исследуютего гомогенность в капле фосфатносолеваго буфера на стекле. При отсутствии спонтанной агглютинации его используют для постановки реакции коагглютинации, При наличии спонтанной агглютинации реагент бракуют.Для постановки опыта к 2-3 каплям реагента на часовом. или предметномстекле добавляют 1 каплю 1%-ной взвеси несенсибилизированных стаФилококков. Капли на обоих стеклахразмешивают осторожным покачиваниемв течение 0,5-3 мин. Результаты реакции учитывают путем просмотра каРезультаты коаг- глютинации Полученные из НИИЭМ им. Н, Ф. ГамалеиЯ. епйегСЫы м.ч. Депонированные в Институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тара- севича Я. гурЬипцгдцш 978 ЯсЬо 1 егаевЫв 7378 пель над вогнутым зеркалом и регистрируют появление агглютинации стафилококков. Интенсивность реакции обозначается по 4-плюсовой системе, как всякая реакция агглютинации.Образуется очень мелкий агглютинат и степень выраженности реакции определяется не столько размерами агглютинированных частиц, сколько степенью просветления жидкости в капле. При отрицательной реакции признаков агглютинации нет, жидкость гомогенно мутна.П р и м е р. Исследуют согласно предлагаемому способу штаммы сальмонелл, полученные из НИИЭМ им, Н. Ф, Гамалеи, выделенные от больных, и музейные культуры сальмонелл, депонирование в Институте стандартизации и Я, ТурМшцг 1 цш 415Я, ТурЬипцгьцш м,ч.8. ТурЬ 1 шцгцш МЯ. Турйшцгдцш 1 б8. ТурЬдшцгцш 17Я. ТурЬ 1 шцг 1 цш 18Я. ТурЫшцг 1 цш 19Я. ТурЬцдцг 1 цш 118Я. ТурЬшцгцш 748. ТурМшцг 1 цш 32Я. ТурЬдшцгдцш 33 255578 4контроля медицинских биологическихпрепаратов им, Л. А. Тарасевича.Результаты исследований представленыв таблице,5Как видно из таблицы, международные эталонные штаммы сальмонелл(Штамм Н-)0407), дают положительнуюреакцию коагглютинации. Штамм К. рпецшоп 1 а, не продуцирующий энтеротоксин и служащий контролем, характе-.ризуется отрицательной реакцией, Интенсивность продукции энтеротоксинадругими испытуемыми штаммами сальмонелл оказалась различной (от 0 доКонтроль Фосфатный буфер К 1 еЬвсе 11 а рпещпоп 1 аЯТ 9"19 Е. сонг НСоставитель Н. ХрусталеваТехред М.Ходанич Корректор М, Максимишинец Редактор И. Дербак Заказ 4779/26 Тираж 778 Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5