Способ получения пептида-ингибитора желудочной секреции

,.801247013 А 1 д) 4 А 61 К 35/20 С 07 К 1 14 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ В ФЖВ йаОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;,3 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДАИНГИБИТОРА ЖЕЛУДОЧНОЙ СЕКРЕЦИИ,-путем гидролизах-казенка, последовательной гельфильтрации на сефадексеи лиофилизации целевого продукта,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения ингибиторной активности пептида после гельфильтрации на сефадексе 0-10, отбирают про-дукт, выходящий вторым пиком на хроматограмме и проводят его дополнительную очистку, при этом для фракционирования используют ступенчатыйградиент рН 2,2; 3,25; 4,35, создаваемый натрий-цитратным буфером накатионообменнике дауэкс 50 х 2 (200 -400 меш), образец, вышедший йятымпиком на хроматограмме, вновь подвергают гельфильтрации на сефадексе0-10, и целевой продукт, вышедший впервом пике на хроматограмме, лиофилиэуют ,г,Выход составляет 1200 мг. Получен 25 ЗО 35 40 45 50 55 Изобретение относится к препаративной биохимии, в частности к способам получения ферментов.Цель изобретения - повышение инги биторной активности пептида за счет проведения дополнительной очистки с использованием ступенчатого градиента рН, создаваемого натрий-цитратным буфером на катионообменнике дауэкс 50 х 2 и повторной гельфильтрации на сефадексе С,П р и м е р 1, Для выделения ингибитора проводят получение ферментативного гидролизата ж -казенка и выделение пептида - ингибитора желудочной секреции кислоты аПолучение ферментативного гидролизата ж -казеина.К 8 л обезжиренного молока прибавляют по каплям раствор 1 н, соляной кислоты при постоянном перемешивании до рН 4,6 оставляют формироваться осадок казеина в течение ночи на холоде (5-3 С), отделяют от сыворотки Фильтрацией через ткань. Вес осад" ка 1000-1200 г.Из общего казеина вьщеляют ж -казеин. Для этого навеску сырого казенка (1200 г) растворяют в,мочевине (конечный объем 3 л; концентрация мовечины - 6,6 М), добавляют 6 л дистиллированной воды и при постоянном перемешивании прибавляют 7 н, раст.вор серной кислоты до рН 1,5 и оставляют для Формирования осадка на 3-4 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют Фильтрованием через бумажные складчатые Фильтры или центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин и отбрасывают, Иэ фильтрата (центрифугата) высалива.ют эс -казеин сернокислым аммонием (при концентрации 132 г на 1 л Фильтрата) и оставляют формироваться осадок в течение 1 ч, а затем отделяют Фильтрованием через бумажные Фильтры. Осадок ж -казеина (120 - 140 г) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды прн подщелачивании 5 н, раствором гидроокиси натрия до рН 8,0 и освобождают от сернокислого аммония диалиэом против 0,04 -ного раствора хлористогонатрия.В полученном после диализа растворе Х -казеина определяют концентрацию белка по калибровочной кривой зависимости оптической плотности при длине волны 280 нм от концентрацииХ-казеина, разбавляют дистиллированной водой до 4 Х-ной концентрации продукта и прибавляют .хлористый кальций до концентрации 0,8 г на 100 мл раствора. Доводят рН раствора до 5,651 н. раствором соляной кислоты, прибавляют навеску пепсина, растворенного в небольшом количестве воды,чтобы фермент-субстратные отношениябыли равны 1:200, и инкубируют120 с при 37 С. Из ферментативногогидролизата удаляют интактный белоки крупные полипептидь осаждением ихтрихлоруксусной кислотой с конечнойконцентрацией 127 Осадок отделяютфильтрованием через бумажный фильтри отбрасывают, а Фильтрат разливаютв целлофановые мешочки и проводят диализ против дистиллированной воды. Полноту диализа устанавливают по ную супернатантную фракцию гидролизата подвергают фракционной очистке,Выделение пептида - ингибитора желудочной секреции кислоты. 200 мг полученной на предыдущей стадии лиофилизованной супернатантной Фракции гидролизата в 2 мл 0.,01 М раствора аммиака разделяют на колонке. сефадекса С(1,5 х х 85 см),уравновешенной раствором аммиака, со скоростью 60 мл/ч, Собирают Фракции по 3 мл. Выход материала с колонки на всех стадиях разделения регистрируют с помощью регистратора измерений электропроводности и процента поглощения света -РЭППС 1 М при длине волны 260 нм и автоматически записывают на самописце КСП. Материал, выходящий на хроматограмме вторым пиком (Б-пик) в объеме 140-190 мл, собирают и лиофилиэуют. Он составляет 653 от нанесенного на колонку образца. 250 мг Б".пика в 2,5 мл 0,01 М раствора аммиака разделяют на колонке сефадекса С(1,5 х 105 см) в 0,01 М растворе аммиака со скоростью 60 мл/ч. Собирают Фракции по 2 мл, Материал, выходящий на хроматограмме третьим пиком (53-пик) в объеме 160-190 мл, собира,ют и лиофилизуют. Он составляет 15,2 Ж от нанесенного на колонку образца,200 мг БЗ-пика в 2 мл 0,01 М раствора аммиака разделяют на колонкесефадекса С(1,5 х 70 см) в 0,01 Мрастворе аммиака со скоростью25 мл/ч. Собирают фракции по 2,5 мл.Материал, выходящий на хроматограмме вторым пиком в объеме 75 - 95 мл(Б 32-пик), собирают и лиофилизуют.Он составляет 487 от нанесенного наколонку образца.120 мл Б 32-пика растворяют в 4 млстартового 0,2 М натрий-цитратного.буфера 2,2 и наносят на колонку с катионообменной смолой дауэкс 50 х 2(200-400 меш), размером 2,5 х 40 мм,уравновешенную этим же буфером. Элюцию проводят со скоростью 30 мл/чсначала стартовым буфером в объеме120 мл, после чего переходят на0,2 М натрий-цитратный буфер рН 3,25которым элюируют также 120 мл, после чего сменяют его на 0,2 М натрийцитратный буфер рН 4,25 и собираютпик, выходящий на хроматограмме вэтом градиенте рН пятым (7-пик) сначала хроматограммы в объеме 300 -350 мл.Материал Ч-пика лиофилизуют,растворяют в 4 мл 0,01 М растворааммиака и наносят на колонку С(1,5 х 100 см), уравновешенную 0,01 Мраствором аммиака. Скорость Фильтрации 15 мл/ч. Собирают Фракции по2 мл. Материал, выходящий на хроматограмме первым пиком в объеме 55 -90 мл (7-1-пик), представляет собойконечный препарат, Его собирают илиофилизуют. Выход образца 8,37 отнанесенного пика Б 32.По мере очистки препарата определяют ингибиторную активность фракцийв остром опыте на крысах с перфузируемым желудком, находящихся подуретановым наркозом. В основе методики тестирования метод непрерывной количественной регистрации соляной кислоты в желудке. Белых крыссамцов линии Вистар массой 180. -200 г, голодавших 18-20 ч, анестезируют внутрибрюшинным введением уретана в дозе 1,5-1,75 г/кгмассы тела. В полость. желудка вводят канюлидля перфузии. Перфузию осуществляют с помощью перестапьтического насоса 10 мМ трис-НС 1 буфером рН 7,4 - 557,5, подогретым до 37 С. Скоростьперфузии 40 мл/ч. В перфузате непрерывно определяют концентрацию протоа н кцияроли 10 3 3 9 1247013 4нов с помощью иономера ЗБ, оснащенного термостатируемой проточнойкюветой. Данные измерения автоматически. записываются на самописце5 КСП. Величину секреции кислоты желудком вычисляют по площади пикаили впадины, записанной на ленте самописца, и относят ко временизакоторое оно произошло, и к массеживотногоОценку ингибиторного действия вы"деляемых пептидных ракций производят по их способности снижать стимулированную инфузией пентагастри 15 на желудочную секрецию кислоты.Пентагастрин инфузируют через полиэтиленовый катетер в вену нижней конеч"ности в количестве 0,5 мкг.ч. Привыходе секреции на постоянный уро- , 20 вень вводят исследуемые пептидывнутривенно в дозе 0,2 - 10 мг наживотное.П р и м е р 2. Проводят аналогично примеру 1, только ракция Б 3225 дважды подвергалась хроматографиина колонке с сефадексом С. Приэтом удельная ингибиторная активность соответствующих фракций существенно не увеличилась. После первой ЗО рехроматографии фракция (Б -32)при дозе 3 мг на животное вызываласнижение на 403 стимулированной пентагастрином секреции кислоты, а послЕ второй рехроматографии фракция(Б -32) в такой же дозе снижала секрецию на 47 Х.В таблице представлены данные поингибиторной активности пептидныхФракций гидролизата по мере очистки 4 и выделения препарата5 1247013 6 Продолжение таблицы Как следует из таблицы, введениедополнительной стадии очистки ионо 3обменной хроматографией с последующим разделением гельфильтрацией при 405 вело к 2-кратному возрастанию активности препарата, в то время как ис-.3 47 пользование только гель-хроматографической очистки не дает повышенияактивности. 2 Б -32 3 1Б -32 Составитель А.АгуреевТехред И.Гайдош Корректор М.Шароши Редактор К,Волощук Заказ 4042(6 Тираж 660 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5