Способ определения кислотности фагоцитов

2Кислотность определяют по образоанию осадка в реакции между Сц+-4ГРе(СМ)Ь 3 , которые в нейтральном астворе образуют осадок ферроцианиа меди2 Сц+ ГРе(СВ)ь 3 -Сцен Ре(СБ)4.Добавляя предварительно в раствор азличные количества хелатообразующе о агента - цитрата, можно вызывать ормирование осадка ферроцианидаи при строго определенных значеях рН в пределах от 3,00 до 5,00 на основании этого построить кабровочную кривую.Состав опытных смесей для построе. я калибровочной кривой; среда 199, зличные количества цитрата натрия, ответствующие количества хлорида трия, 125-175 мкМ сернокислой меди; -30 мкМ ферроцианида калия.Количество цитрата натрия, вводие в опытные смеси, варьирует от 235000 мкМ, определяется.по формуУ = 5,212 Х,где Х - концентра,О 55я цитрата натрия, мкИ, У - значее рН, и зависит от определяемой личины рН. Нижние значения цитрата трия обусловлены максимально возжной точностью дозаторов, превышее верхнего предела значений цитранатрия приводит к нарушению услой изотоничности опытных смесей. Коннтрационные значения всех .других агентов находятся в зависимости от нцентрации цитрата натрия, изменеих в любую сторону от указанныхелов ведет к нарушению закономер ти протекания реакции.Кислотность фагоцитов определяют сением их с фагоцитируемым матеом в опытные. смеси и электроннороскопически регистрируют в клетобразование осадка ферроцианида и.П р и м е р 1. Построение кривой мирования ферроцианида меди при 3,00-5,00 в зависимости от конценти цитрата натрия (см. табл,). Исходный рН растворов 7,2, рН творов изменяют добавлениемн. НС 1 под контролем рН-метра- 340), Светопоглощение оценивана спектрофотометре СФпринм.В результате проведенных исследоий получена кривая образованияка ферроцианида меди при опреенных значениях рН в зависимости концентрации цитрата натрия. Урав 1 1091068Изобретение относится к биохимиии может быть использовано в медицин- вской цитохимии для исследования пато илогии клеток.Известен способ определения кис 5 длотности фагоцитов путем флуоресцентной спектроскопии, основанный натом, что спектр возбуждения флуорес- рцина изоглиоцианата является чувст- гвительным к рН среды Г 1 3. 10 фОднако чувствительным участком медданного способа является рН от 5 нидо 7, тогда как за этими пределами испособ нечувствителен.лиИзвестен также способ определениякислотности фагоцитов путем смешива- ниния их с фагоцитируемыми частицами, рапоследующей инкубации смеси и добав- соления реагента для определения рН, насреды Г 21.20Однако при известном способе используются индикаторные красители, мотакие, как нейнтральный красный, добромкрезоловый фиолетовый, бромкре- ле.золовый зеленьй, бромфеноловый синий 2 циф 25которые имеют интервал перехода окраски 2 ед. рН. В этих пределах происходит плавный переход окраски черезвсе цветовые оттенки, визуально труд-но отличимые друг от друга, Все этоделает точность измерения рН с исполь 30зованием перечисленных индикаторовравной половине интервала перехода цеокраски красителя, а именно 1 ед. рН. реЦель изобретения - повышение точ- коности способа при определении функ- З 5 ниециональной активности клетки. предУказанная цель достигается тем. носчто согласно способу определениякислотности фагоцитов путем смешива- внения их с фагоцитируемыми частицами 40 риалс Последующей инкубацией смеси и оп- микределением рН среды с помощью индика- кахтора, в качестве индикатора исполь- мед зуют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, за фор тем в ряд инкубационных смесей добав- рН ляют цитрат натрия от 2 мкИ до обра- раци зования ферроцианида меди в исследуемой пробе, а кислотность фагоцитов рас (У) определяют.по формуле 50 0,4У - 5 212.Х (рН где Х - концентрация цитрата натрия ютв пробе с образовавшимся 565ферроцианидом меди, мкМ.Образование ферроцианида меди оп ван ределяют электронномикроскопически. осадСпособ осуществляют следующим дел . образом.от15 3 10910 нение регрессии, рассчитанное методом наименьших квадратов, имеет-о,оЯ следующий вид:У = 5,212 Х ,где Х - концентрация цитрата натрия, мкМф У - значения рН. Коэффициент корреляции равен г = 0,996 (р (0,001). Полученная кривая использована при изучении рН в фагоцитируемых вакуолях клеток в системе 1 п чегго,фагоциты получают промыванием брюшной полости мышей СВА раствором Хенкса: на 250 мл - 500 мг бычьего сывороточного альбумина и 5000 ед. гепарина. Клетки осаждают центрифугированием в течение 8 мин при1200 об/мин на холоде, После этого осадок ресуспендируют в растворе Хенкса с 0,2 Е-ным бычьим сывороточным альбумином и вновь центрифугируютпри тех же режимах, Клетки ресуспендируют в среде 199 и инкубируют в опытных смесях (1-7). Время инкуба ции составляет 60 мин на водяной бане нри 37 оС и постоянном встряхивании (амплитуда - 4, частота - 1 Бп 1 чегза 1 зЬаЕеггуге 327). В качестве фагоцитируемого материала используют частицы латекса. Количество клеток в инкубационной среде 1 хх 10 к/мл.ЬЗОПосле инкубации клетки осаждают центрифугированием (3000 об/мин в течение 5 мин) и готовят стандартно для электронномикроскопических исследований, Для этого полученные; 35 осадки фиксируют в 4 Х-ном растворе параформальдегица на растворе Хенкса в течение 3 ч, постфиксируют .13-ным раствором четырехокиси осмия в течение 3 ч, обезвоживают в возрастающем ряду ацетона (от 70 до 1003), 4 заливают в смесь эпок-аралдит, поли- . меризуют в течение 48 ч. Ультратонкие срезы получают на ультрамикротомах фирм ф 1.КВ" (Швеция) и "Зогча 11" (США). Материал просматривают в электронных45 микроскопах при ускоряющем напряжении 60-80 кВ.П р и м е р 2. Все продукты полностью соответствуют процедурам, описанным в примере 1, за тем лишь ис 50 ключением, что в качестве фагоцитиру. емого материала вместо частиц латекса используют опсонизированный зимозан.В фагосомах макрофагов, содержащих 55 частицы латекса или зимозана, которые инкубировались в опытных смесях, формирующих ферроцианид меди при рН 68 44,50-3,75, наблюдают электронноплотные осадки. Тогда как в микрофагах, инкубированных в смесях, дающих осадок при рН 3,50-3,00 электронноплотных осадков не найдено. Таким образом, используя предлагаемый способ, установили, что нижний предел закисления рН в фагоцитируемых вакуолях макрофагов колеблется между 3,50 и 3,75.Найдено также образование электронноплотных осадков не только в полностью сформировавшихся фагосомах с поглощенными частицами, но и в местах контакта фагоцитируемого материала (зимозан) с плазматической мембраной макрофагов, Глубина закисле-. ния в местах контакта также находится в пределах рН 3,50-3,75.Предлагаемый способ позволяет регистрировать электронноплотные осадки без дополнительного контрастирования ультратонких срезов. Однако, при необходимости контрастирования можно использовать только уранилацетат, но не цитрат свинца; так как его раствор вызывает растворение осадка ферроцианида меди. Для доказательства того, чтоэлектронноплотные осадки формируются именно в результате изменения рН,а не из-за усиленной генерации супероксидных радикалов, была поставлена контрольная реакция. В отсутствии клеток была проверена опытнаясмесь в системе квантиноксидазы,продуцирующей суперксидные радикалыи имитирующей тем самым аналогичноефункционирование фагоцитирующих клеток. Даже заведомо больший уровеньсуперксидных радикалов, чем в известных биологических системах, не вызывает образования осадка ферроцианидамеди в исследуемой опытной смеси.Проведена контрольная реакцияпри 2-4 С и в присутствии 0,27.-ного,раствора азха натрия для доказатель 1ства того, что наблюдаемые электронноплотные осадки представляют собой результат Функционирования фагоцитирующих клеток и их ферментных систем.Эти условия не препятствуют толькоприлипанию Фагоцитируемого объектак клетке, большинство же протекающихбиохимических процессов ингибируются. При таких условиях никаких электронноплотных осадков в клетках ненаблюдают,Пример6 Смесь Состав 2 3 4 5 д Среда 1990,1 М цитрат натрия, мл(КаС НО-25,8 г/1000 мл) ую опытную сме с10 мл01 02 1 95 На к аж0,025 О,и о 0,427 М хлорнатрия, мл 34 2 34,975 34,85 34(НаС 1 -25,:8 г/1000 мл30 мМ сернокис лая медь(Сц 80,5 Н 207,5 г/1000 мл) На кажду тную смесь по 5 мл 5 мМ ферроцианидкалия(КГе (СИ) ЗН О- 2,11 г/1000 мл) ую сме сь по ую опы 0,5 мла к а Дистнллированнвода На к аждую тную смесь по Составитель Е,Житниковадактор Л,филь Техред Т.фанта КоРРектоР В сутяга аказ 3073/40 Тираж 823 ВНИИПИ Государственного комите по делам,изобретений и откр 113035, Москва, Ж, РаушскаяПодписноа СССРтий наб., д. филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул,Проектная,1091068 бИз результатов двух проведенных гоцитируемым объектом соединения, контрольных реакций видно, что элект 1 вступающие в реакцию при кислых знаронноплотнцй осадок ферроцианнда ме- чениях рН, появляется возможность ди формируется именно при кислых испольэовать в качестве фагоцитирузначениях рН, которые являются ре емого материала значительно большее зулътатом функциональной активности количество. инициаторов фагоцитоза. клеток. При известных способах таким матеПриведенные примеры свндетельст- риалом служат только дрожжевые клетки. вуют о том, что предлагаемым спосо- Изучаемые предлагаемым способом бои можно определить рН субклеточных 10 свойства определяют бактерицидное структур, получаемые данные имеют действие фагоцитирующих клеток на высокую точность (определение рН ко- потогенные микроорганизмы, осуществ. леблется в пределах 0,25, в то вре" ,ление антиопухолевогоконтроля в мя как при способе световой микро- организмах и т,д. Способ применим скопни этот предел составляет 1,0). 15 как для изучения механизмов, происВ связи с тем, что исчезает необ- ходящих в клетках, так и воэможньи ходимость химически связывать с фа- патологических отклонений от нормы.