Способ определения полиаминов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 9 И 091069 ЗСЮ С 01 М 33 4 ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИ 4 21 3435633/28-13(72) С,П. Сяткин и Т.Т. Береэов (71) Университет дружбы народов им. Патриса Пумумбы(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАИИЯОВ путем гомогениэации биологической ткани, даисилирования гомогената,экстрагироваиия дансилированных полиаминов с последующей тонкослойнойхроматографией в системе растворителей, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью ускорения способа, хроматографию проводят в системе растворителей бенэол-триэтиламин в соот-ношении (5: 1)-(5,511)1 10910Изобретение относится к биохимиии может быть использовано для определения полиаминов в тканях животныхи человека,Известен способ определения поли 5аминов и их производных с помощьюферментативных реакций 1 3,Известен также способ определенияполиаминов с использованием флуоресцирующего реагента и последующей .хро Оматографией в тонком слое 23.Недостатком известного способаявляется использование несколькихсложных раствоРителей, что значительно удлиняет время проведвния анализа. 15Цель изобретения - ускорение способа.Укаэанная цель достигается тем,что согласно способу определенияполиаминов путем гомогенизации биологической ткани, дансилирования гомогената, экстрагирования дансилированныхполиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей хроматографию проводят в системе растворителей бензол-триэтиламин в соотношении (5: 1)-(5,5:1).Способ осуществляют следующим обраэом.Для анализа используют ЗЗХ-ныйсвежеприготовленный гомогенат печени(соотношение массы и объема 1:2),Ткань гомогенизируют в 0,05 мМфосфатном буфере рН 7,2, содержащемО, 1 ммоль/л дитиотреитола ("Яега",ФРГ) и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфата ("Кеапа 1", Венгрия), Все манипуля,ции с тканью проводят на холоде при2-4 оС,Экстрагирование полиаминов проводят равным объемом 0,2 М НС 1041 Пробы 40центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. К О, 1 мл супернатанта добавляют О, 3 мл раствора дансилхлорида ("БсЬцсЬагйс", ФРГ) в ацетоне (4 мг/мл)и Ь мг БаСОЗ 10 Н 20, Пробы инкубируют 18-20 ч в темноте при комнатнойтемпературе. Продукты реакции экстрагируют 0,5 мл бенэола, Органическийслой .переносят в коническую центрифужную пробирку и оставляют выпариваться на ночь при комнатной температуре в темноте.Осадок растворяют в 20 мкл бенэола и наносят на пластинки ручногои пррмышленного изготовления ("Кача 1 ег", Чехословакия). Суспенэиюготовят с двойным количеством водыиз расчета 28 г сухого силикагеля 69 2марки ЛС 5/40 ("СЬешаро 1" Чехословакия) на 1 см поверхности. Связывающим веществом является гипс (5"15 ) Пластины высыхают эа ночь при комнатной температуре. Активирование проводят при 110 С в течение 30 мин.На остывшую пластину наносят одновре. менно до,10 проб на расстоянии 2 см от нижнего и боковых краев. Готовые пластины "Зд 1 ийо 1 ц 7-254" с подломкой из алюминиевой фольги в качестве сорбента имеют широкопористый силикагель по Петри с люминесцентным индикатором. Связывающим веществом служит крахмал.Одномерную хроматографию проводят двукратно в системе бензол-тризтиламин в соотношении 5: 1-55:1 в течение 45 мин, Дансилпроизводные аминокислот и гидролизованный реактив остаются на линии старта. Избыток дансилхлорида не мешает идентификации пятен, Пятна дансилполиаминов обнаруживают по желто-зеленому свечению в ультрафиолетовом свете. Идентификацию пятен фракций полиаминов проводят с помощью свидетелей - препаратов солянокислых производных путресцина, спермидина и спермина ("Веда", ФРГ).Интенсивность флоуресценцин измеряют прямым сканированием пятен на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С. Для регистрации интенсивности излучаемого света используют интерференционный светофильтр В 4-6 с длиной волны в максимуме пропускания=488 ммк,шириной пропускания в середине максимума Д = 10 ммк и коэффициентом пропускания Ткс= = 22 Х. Напряжение ФЭУ равно 700 В. Длину волны возбуждения 1 = 365 ммк получают с помощью фильтров УФС(толщина 5 мм) и СЭС(толщина 4 мм). В качестве источника света используют лампу ДРШ.-2.Концентрации полиаминов рассчитывают по калибровочным графикам и выражают в, нмоль/мг белка. Белок опре,деляют по Лоури.П р и м е р 1. В качестве модели ткани с повышенным мнтотическнм индексом используют перевивные гепатоиы Ги 46, регенернрующую и мадигниэирующую печень, Штамм гепатомы 46 пассируют на самцах мьпией линии СЭНА. Штамм гепатомы Гпассируют, на крысах"самцах рандомбредногоразведения. Частичную гепатэктомию проСоставитель И. ЕмельяненкоРедактор Л, филь Техред Т.Фанта Корректор В,Бутяга Заказ 3073/40 Тираж 823ВНЙИПИ ГосуДарственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1 Оизводят по методу Хиггинса иАндерсона, Иалигнизацию печени крыс вызы"вают нитрозодиэтиламином (НДЭА).НДЭА вводят внутрибрюшинно 1 разв неделю в течение 2 мес. из расчета100 мг на 1 кг веса животного. Всегокаждому животному введено 154 мгканцерогена.Животных забивают путем декапитации. Печень немедленно извлекают,Далее определение полиаминов проводят согласно предлагаемому способус использованием бензол-триэтиламина в соотношении 4,5;1При этом выявлено: Х; путресцин " 0,32; Х 2 - 0; спермидин - 0,37и спермин - 0,42, где Х 1 и Х -фракции неиндентифицированных амйнов.П р и м е р 2. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, нопри соотношении бензол - триэтиламин5:1.При этом выявлено: Х 1 - 0,22;путресцин - О,ЗО; Х - 0,37; спермидин - 0,43; спермйн - 0,54,91069 4П р и м е р 3. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, нопри соотношении бензол-триэтиламин5,5:1,При этом выявлено: Х - 0,23; путресцин - О, 31; Х- О, 37; спермидин 0,44; спермин - 0,53.П р и м е р 4. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, нопри соотношении бенэол-триэтиламин6:1.При этом выявлено: Х - 0, путресцин " 0,32; Х - 0; спермидин - 0,39;спермин - О, 41. 15Таким образом, оптимальным дляхроматографичеекого разделения указан ных полиаминов следует считать 5:.1- 5,5 1 интервалы соотношений компонентов используемого растворителя, при.этом из фракций дансилпроизводных полиаминов удаляются загрязняющие их вещества Хи Х, а время анализа сокращается в 4 раза по сравнению с известным способом.