Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК О 9) аИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ГО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей (53) 577.152(088,8)(56) 1. Романенко Е.Б Обухова Л.К. Изменение метилирования ДНК у мышей с возрастом под влиянием гидрокортизона и антиоксиданта, Научн.докл, высш,школы. - "Биологические науки", 198 1, В 2, с. 63-70.2. Никитинис В.И., Малеева Н.Е., Санько ф.Д., Мирзабеков А.Д, Два простых метода выделения ДНК из различных источников с применением цетавлона, - "Биохимия", 1977, т. 42, вып. 10, с. 1783-1788 (прототип). 11 С 07 Н 21/04; С 12 Р 19/3(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий лизис клеток в присутствии катионно" го детергента, мочевины, этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и снижения примеси рибонуклеиновой кислоты, в качестве катионного детергента используют этоний дихлоридэтилен,2-бис-(диметил,карбодецоксиметил)аммония, а процесс выделения ДНК осуществляют при 3-8 С.6Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине ипредназначено для выделения ДНК изтканей животных,Известен способ выделения ДНК изтканей, заключающийся в том, что пос-,ле разрушения клеток путем инкубации18 ч в среде, содержащей 0,14 М МаС 1,0,01 М цитрата Иа, 0,1 М ЭДТА, 0,57дезоксихолата Ба и проназу, препарат 10трижды обрабатывают хлороформом,осаждают этанолом, инкубируют с РНК-азой,вновь трижды обрабатывают хлороформом,осаждают этанолом и переосаждают изопропанолом 11.15Недостатками такого способа являются шестикратная обработка хлороформом для удаления белка, что делаетспособ весьма трудоемким, продолжительность процедуры выделения (4872 ч), применение Ферментов - проназы с целью разрушения дезоксирибонуклеопротеидного комплекса (ДНП) иРНК-азы для удаления РНК из целевогопродукта. 25Наиболее близким к изобретению является способ выделения ДНК изтканей животных, включающий замораживание и измельчение тканей с последующим разрушением клеток в, растворе, содержащем катионный детергентцетавлон (ЦТА-Вг), 5 М мочевины,0,1 М ЭДТА, 2 М ИаС 1,Лиэат трижды обрабатывают смесью хлороформа и изоамилового спиртаИз водной фазы спомощью ЦТА-Вг осаждают ЦТА-соль ДНК,35промывают раствором, содержащим О, 1 ЖЦТА, 5 М мочевину и 0,5 М ИаС 1, затемраствором 1 М ацетата натрия в 703-номспирте, 707.-ным спиртом и получают40Иа-соль ДНК, содержащую 10 Е примесиРНК Ц. Известный способ имеет ряд недостатков, а именно: использование в ка честве катионного детергента цетавлона, импортируемого из ФРГ и потому труднодоступного для лабораторий, необходимость проводить манипуляцию выделения ДНК при температуре свыше 20 С из-за плохой растворимости цетавлона при более низких температурах, что влечет за собой потери ДНК в процессе выделения, связанные с де" натурацией ее молекулы, высокая растворимость катионного детергента цетав лона (ЦТА-Вг) в органических растворителях, вследствие чего его концентрация понижается и для ее поддержания детергент приходится добавлять кисследуемому раствору.Целью изобретения является .повышение выхода целевого продукта и снижение примеси рибонуклеиновой кислоты.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу выделениядезоксирибонуклеиновой кислоты,включающему лизис клеток в присутствиикатионного детергента, мочевины,этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, в качестве катионногойдетергента используют этоний дихлоридэтилен,2-бис-(диметилкарбодецоксиметил)аммония, а процесс выделенияДНК осуществляют при 3-8оСпособ осуществляют следующим образом.Извлеченную из организма тканьзамораживают в жидком азоте и растирают до порошкообразной консистенции,отмывают при 40 С 0,01 М фосфатнымбуфером, содержащим 0,14 М МаС 1,лизируют 20 мин при 37 С подогретымдо 50 С раствором, содержащим 1 Е этония, О, 1 М Эдта, 5 М мочевины и 2 М БаС 1.К лизату добавляют равный объем хлороформа, интенсивно встряхивают 10 мини центрифугируют 15 мин нри 4000при 4-8 С, отсасывают водно-солевуюоФазу. Осаждают ДНК из водно-солевогораствора, почижая концентрацию ИаС 1до 0,5 М путем прибавления 5 М раствора мочевины, Осадок отмывают ирастворяют в соответствующем буферном растворе, а затем очищают от примесей РНК,П р и м е р 1. Навеску ткани сердца от 5-5 крыс (около 4 г) измельчают, замораживают в жидком азоте, растирают в фарфоровой ступке и отмывают в 40 мл 0,01 М фосфатного буФера рН 7,4, содержащего 0,14 М ИаС 1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин при 4000 я, осадок ресуспендируют в 7 мл 0,01 М Фосфатного буфера рН 7,0 и добавляют к 38,5 мл подогретого до 50 С раствора, содержащего 17. этония, 0,1 М ЭДТА, 5 М мочевину и 2 М ИаС 1, Смесь энергично встряхивают и оставляют на 20 мин в термостате при 37 С, Затем к смеси добавляют равный объем хлороформа, энергично встряхивают 10 мин и центрифугируют 15 мин при 4 000 я и температуре 4-8 С. Водную фазу отсасыУвают и вновь обрабатывают хлороформом до полного исчезновения слоя наз 10811границе раздела органической и водной фаз. К водно-солевому растворунуклеиновых кислот добавляют 2,33объема 5 М раствора мочевины. Полученный осадок отделяют, отмывают врастворе, содержащем 0,5 М ИаС 1,5 М мочевину и 0,13 этония, а затемтрижды в О, 1 М ацетате На в 70 этадноле и наконец в 70 и 9611 этаноле,Полученную этониевую соль ДНК растворяют в 18 мл О, 14 М ИаС 1.После полного растворения осадкадобавляют 2 мп раствора, содержащего2,5 М ацетата Яа и 0,001 М ЗДТА,тщательно перемешивают. ДНК в виде 15На-соли осаждают, добавляя к раствору 0,54 объема изопропанола. Образовавшийся осадок Иа-соли ДНК извлекают стеклянной палочкой и вновь растворяют в О, 14 М ИаС 1. К полученному 20однородному вязкому раствору добавляют смоченный водой активированныйуголь в количестве 15-207 от объемараствора и вьдерживают в течение 1 чпри 4 рС, постоянно помешивая. Уголь 25отделяют центрифугированием, а ДНКв виде Иа-соли вновь осаждают изопропанолом. Полученную таким образом ДНКпромывают в 96 этаноле, в смеси этаонол - этиловый эфир 1:1, в эфире ивысушивают сначала на воздухе, а затем при 100 РС. Из 4 г ткани сердцакрыс получают 4-6 мг очищенного препарата ДНК.П р и м е р 2. В качестве исходного материала используют селезенкикрыс.Способ выполняют аналогично примеру 1, но ткани для исследования берутв количестве 2 г, а фосфатного буфе рра и лизирующего раствора 10 и 55 млсоответственно.В результате из 2 г ткани селе, зенки крыс получают 15-17 мл очищенного препарата ДНК.45Опытным путем установлено, чтопри вьделении ДНК по известному спо-,собу выход ДНК составляет 70-757. (20исследований), по предлагаемому - до857 (20 исследований).Таким образом, выделение ДНК попредлагаемому способу позволяет получить положительный результат путем применения детергента этония, выпускаемого отечественной промьппленносческое вещество.Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что процесс выделения выполняется при температуре 8-4 С, что препятствует де"натурации молекулы ДНК и снижает потери ее в процессе вьделения. Крометого, в отличие от известных способов, предлагаемый позволяет вьделитьДНК из тканей с низким ее содержанием, что необходимо для изучения механизмов регуляции биологических процессов на уровне матрицы ДНК не только в активно пролиферирующих тканях(лимфоидные органы, печень), но ив тканях с относительно малым содержанием ДНК (сердце, эндотелий сосудов) .Сравнительная оценка результатоввыделения ДНК различными способамипредставлена в таблице.Ниже приведены данные о свойствахи характеристиках препаратов ДНК,полученных предлагаемым методом изселезенки и сердца крыс./Молекулярный вес 17,7710млн. дальтоновГиперхромный эффект, 7. 30,0 ф 4,0Содержание фосфора,7. 9,90+1, 1П;.:месь РНК. 3 0,020,20Примесь полисахаридовПримесь деградированных продуктов ДНК,РНК НетЕ р/Ео 2,4Температура плаволения, С Нет 72, О+1, 1 71 4тью, позволяющего проводить выделение ДЧК в оптимальном температурном ре" жиме.Существенное преимущество предложенного способа заключается в применении в качестве детергента этония дихлоридэтилен 1,2-бис-(диметилкарбодецоксиметила) аммония химической формулыСН М(СН )СООС 1 рН2 С 1Фплохо растворимого в органических растворителях и хорошо растворимого в воде при низких температурах, ранее использовавшегося как антисепти1081171 кань гЬо/Ег 8 Примеси, 7 Количест К, Х Н елок Известный способ Выделитьне удалось ердце Селезенк Предлагаемый спосо 30 ерд 1,93 2,3 Селезен Заказ 72/21 Тираж 381 ВНИИПИ Государственногопо делам изобретений и 13035, Москва, Ж, Рауш ное Под омитета СССР