Способ определения структуры триглицеридов природных и модифицированных жиров

,.801024833 А СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 56 . 601 й 33 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ НИ ланом дигли 21) 3363314/28-13 (54)57) СПОСОВ ОПРВДВЛЯНИЯ УРУКТУ 22) 26.11. 81 РЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИ 46) 23.06.33. Бюл, Р 23 , . ЦИРОВАННЫХ ЖИРОВ, включающий гидро 72) О,В.Озеринина, В.В.Чупин, лиэ тригЛицеридов панкреатическойА,П.Нечаев, Н.С.Гейко, Г,А.Серебрен- липазой, фосфорилирование диглицериникова И Р.П.Евстигнеева .:дов и гидролиз фосфолипазой А,71) Московский. ордена Трудовогоо т л и ч а ю ц и й с я тем,что,с целью сокКрасного Знамени технологический ,рацения времени анализа, фосфорилироинститут пищевой промышленности и ванне диглицеридов осуществляютМосковский ордена Трудового Крас- , 2-хлор-оксо,3,2-диоксафосфоного Знамени институт тонкой хими- в количестве" 3-4 молей на мольческбй технологии им. М.В.Ломоносовацеридов пои 40-450 С в течение53) 665.014 (088.8) 30-60 мин.56) 1. физиология и биохимия культурных растений. 1977, 9 4,с. 346"3512. Физиология и биохимия культур- Зних растений. 1978, 1 Р, с. 48-53,1024833 СБРОСОВ СИОИ ОИ гО С 2 Н О-Р,Ц О - ИИ О 2СН оСоаСНОСОВ Со ОСОЙИзобретение относится к способам определения состава и, строения триглицеридов и может быть использовано йля установления триглицерилной структуры природных и модифицированных жиров, применяемых в пищевой промыш ленности.Известен способ. определения структуры триглицеридов, включающий гидролиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицери- (О дов и гидролиз фосфоглицеридов фосфолипазой А, в котором гидролиз триглицеридов осуществляют в среде аммонийного буфера в присутствии хлористого кальция и дезоксихолевой кислоты при 37 С в течение 30-40 мин. Фосфорилирование диглицеридов проводят фенилдихлорфосфатом при 20 С в течение 3 ч и для более полного протекания реакции фосфорилирования выдерживают реакционную массу 36-40 ч при комнатной температуре. Синтезированные фосфоглицериды гидролизуют .Фосфолипазой А 2 при 30 С .в течение 4 ч (.1).Недостатком этого способа является, прежде всего, необходимость отделения симметричных диглицеридов, образующихся при гидролизе, от несимметричных, используемых далее на второй стадии анализа. Основным недос татком данного способа является длительность реакции Фосфорилирования диглицеридов.Наиболее близким к изобретению является способ определения структу-. З 5 ры триглицеридов, включающий гидрошиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов -фталимидоэтилфосфатом в присутствии триизопропилфенилсульфо-40 хлорида (ТРЗ) и гидролиз синтезиОр О-СоИР -Ро - Щ Способ осуществляют следующим образом.Проводят гидролиз жиров панкреатической липазой, Фосфорилирование диглицеридов 2-хлор-оксо,3,2- диоксофоланом и гидролиз фосфогли" церидов фосфолипазой А.П р и м е р 1. Определяют структуру триглицеридов природных жиров. В круглодонную трехгорлую колбу на 100 мп помешают 0,4 г исследуемого жира туда же добавляют предвари" тельйо выдержанные при 40 С 5 мл 0,11 М раствора хлористого кальция, ,65 рованных фосфоглицеридов Фосфолипазой А. Гидролиз триглицеридов панкреатической липазой проводят в среде трис -НС 8 буфера в присутствии хлористого натрия и хлористого кальция при 39 С в течение 15 мин. Фос-. форилирование диглицеридов осущест" вляют -фталимидоэтилфосфатом в присутствии ТР 5 при 65 фС в течение 3 ч. Гидролиз синтезированных фосфоглице" ридов производят в течение 10 ч при 30 фС (2(.Однако в данных условиях фосфорилирования не исключено перекисное окисление липидов и ацильная миграция. Снижение времени фосфорилирования и температуры реакции уменьшает вероятность того и другого про" цесса. Кроме того, недостатком известного способа является более длительный гидролиз фосфоглицеридов Фосфолипазой АЦелью изобретения является сокращение времени анализа.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения структуры триглицеридов природных и модифицированных жиров, включающему гидролиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов и гидролиз фосфоглицеридов фосфолипазой А 2, фосфорилирование диглицеридов осуществляют 2-хлор-оксо,3,2-диоксафосфоланом в количестве 3-4 молей на моль диглицеридов при 40-45 С в течение 30-60 мин.В предложенном способе получаемые фосфоглицериды по своей структуре близки к природным фосфолипидам и поэтому являются лучшим субстратом для фосфолипазы А, за счет чего и снижена продолжительность их гидролиза. 30 мл 1 н. раствора хлористого натрия, 20 мл 1 М.трус -НСР буфера(рН 8,0) и 0,08 г панкреатическойлипазы (активность 47,3, марка А),растворенной в 3 мл 0,01 МЬ-гистидина, Гидролиз триглицеридов проводят при .интенсивном механическомперемешивании Ь токе азота в течение 2,5 мин при 40 С и останавливаютдобавлением 15 мл 4 Ъ соляной кислоты."Экстракцию проводят диэтиловым эфи"ром, Полученный эфирный экстрактпромывают водой до нейтральной реакции и сушат над прокаленным сульфатом натрия. Эфирный экстракт декан=" тируют, растворитель удаляют под вакуумом. Продукты гидролиэа выделяют препаративной тонкослойной хроматографией (ТХС) на силикагеле ЛС 5/40 6. Проявление ведут в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота(50:50:1), Фракции обнаруживают парами иода и фиксируют. Полученные. моноглицериды и диглицериды экстрагируют с силикагелем диэтиловым эфиром. Растворитель отгоняют под вакуумом, Состав жирных кислот исходных триглицеридов и моноглицеридов определяют методом гаэожидкостной хроматографии (ГЖХ). 15Навеску диглицеридов 0,09 (0,000145 моля) растворяют в 2 мл безводного бензала, добавляют 0,4 мл сухого триэтиламина и вводят по каплям при 20 С раствор 0,065 г (0,000438 моль) 2-хлор-оксо,3,2- -диоксафосфолана в 4 мл .бенэола. Реакционную массу перемешивают при 45 С в течение 30 мин. Выпавший осадок хлоргидрата триэтиламина отфильтровывают, к фильтрату добавляют водный бензол и удаляют растворитель под вакуумом. Фосфоглицериды выделяют препаративной ТСХ, используя в качестве проявителя систему хлороформ-метанол-ацетон-аммиак (155:1). Фосфо- ЗО глицЕриды обнаруживают при опрыскивании краев пластин модифицированных реактивом Васьковского (Ру =.0,48) и экстрагируют с силикагеля смесью хлороформ-метанол (2;1). Растворитель З 5 удаляют под вакуумом, Выход фосфоглицеридов 0,07 (65).Навеску фосфоглицеридов 0,07 г растворяют в 5 мл диэтилового эфира. К полученному раствору добавляют 0,014 г лиофилиэированного яда гюрзы, . растворенного в смеси,.содержащей 1 мл,0,1 М боратного буфера (рН 7,2) и 0,1 мл 0,11 М хлористого кальция, Реакционную массу перемешивают при 30 фС в течение 5 ч. Растворитель 45 удаляют под вакуумом, лизофосфоглицериды выделяют препаративной ТСХ в системе хлороформ-метанол-вода при соотношении 65:25 г 4 %0,29), обнаруживают модицифированным реактивом 50 Васьковского. Экстракцию проводят метанолом, растворитель удаляют подвакуумом, Состав жировых кислот лизофосфоглицеридов определяют методом ГЖХе 55 1 О П р и м е р 2. Определяют структуру триглицеридов модифицированныхжиров.В круглодонную трехгорлую колбу на 100 мл помещают 0,4 г расплавлен-, ного гидрогениэированного жира, туда же добавляют предварительно выдержан,ные прИ 40 сС 5 мл 0,11 М раствора хлористого кальция; 30 мл 1 н .раствора хлористого натрия, 20 мл 1 М 65 трис -НС 1 буфера (рН 8,0) и 0,08 г панкреатической липазы (активность 47,3 марка А), растворенной в 3 мл 0,01 М Ъ-гистидина. Гидролиз триглицеридов проводят при интенсивном механическом перемешивании в токе азота в течение 2,5 мин при 40 С и останавливают добавлением 15 мл 4 н. соляной кислоты-, Экстракцию проводят диэтиловым эфиром. Полученный эфирный экстракт проьывают водой до нейтральной реакции и сушат над прокаленным сульфатом натрия. Эфирный экстракт декантируют, растворитель удаляют под вакуумом. Продуктыгидролиэа выделяют препаративной ТСХ на силикагеле лс 5/40 р. Проявление ведут в системе гексан-.диэтиловый эфир-уксусная кислота (50:50:1). Фракции обнаруживают в парах иода и фиксируют. Полученные моноглицериды и диглицериды экстрагируют с силикагеля диэтиловым эфиром. Растворитель отгоняют под вакуумом. Состав жирных кислот исходных триглицеридов и моноглицеридов определяют методом ГЖХ.Навеску диглицеридов 0,087 г (0,00014 моль) растворяют в 2 мл безводного бензола, добавляют 0,4 мл сухого триэтиламина и вводят по каплям при 20 С раствор 0,084 г (0,.00056 моль) 2-хлор-оксо,3,2- -диоксафосфолана в 4 мл бенэола. Реакционную. массу перемешивают при 40 С в течение 1 ч. Выпавший осадок хлоргидрата триэтиламина отфильтровывают. К фильтрату добавляют водный бензол и удаляют растворитель под вакуумом. Фосфоглицериды выделяют препаративной ТХС, используя в качестве проявителя систему хлороформ- -метанол-ацетон"аммиак (15:7;5:1), Фосфоглицериды обнаруживают при опрыскиваниикраев пластин модифицированным реактивом Васьковского у 0,48) и экстрагируют смесью хлороформ-метанол (2:1). Растворитель удаляют под вакуумом. Выход фосфоглицеридов 0,08(75,Навеску фосфоглицеридов 0,08 г растворяют в 5 мл диэтилового эфира. К полученному раствору добавляют 0,016 г лиофилиэированного яда гюрзы, растворенного в смеси, содер-, жащей 1 мл 0,01 М боратного буфера (рН 7,2) и 0,1 мл 0,11 М хлористого кальция. Реакционную массу перемешивают при 30 С в течение 5 ч. Растворитель отгоняют под вакуумом, лизофосфоглицериды выделяют препаратинной ТСХ 8 системе хлороформ-метанол- -вода при соотношении компонентов 65:25:4 (0,29). Экстракцию проводят метанолом. Растворитель удаляют под вакуумом. Состав жирных кислот лизофосфоглицеридов определяют методом ГЖХ.Использование предлагаемого способа. определения структуры тригли1024833 Составитель Н. АфанасьеваРедактор В. Иванова Техред А,вабинец Корректор Г ОгаРЬвй Заказ 4386/41 Тираж 873. . Подписное Вниипи Государственного комитета сСсР по делам изобретенйй и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП фПатент", г. ужгород, ул. Проектная ф церидов природных и мойифицированнвйжиров обеспечивает по сравнению сизвестным следующие преимущества:синтезированные фосфоглицериды посвоей структуре близки к природнымфосфолипидам и являются по этому 5лучшим субстратом для фосфолипазы Аза счет чего достигается снижение с10 до 5 ч времени их гидролиза;исключаетдя использование на стадии фосфорилирования дорогостоящего конденсирующего агента - триизопропилфенилсульфохлорида (ТР 5); снижениепродолжительйости фосфорнлированияс 3 до 1 ч и температуры реакциис 65 до .4045 С уменьшает вероятностьперекисного окисления и ацильноймиграции в ходе анализа, длительностьанализа составляет 20 вместо27 ч,